Özet

Oprode Array para modulação optogenética simultânea e gravação neural elétrica

Published: September 01, 2022
doi:

Özet

Aqui, apresentamos o método de fabricação de um sistema optrode com fibras ópticas para entrega de luz e uma matriz de eletrodos para gravação neural. Experimentos in vivo com camundongos transgênicos expressando channelrhodopsin-2 mostram a viabilidade do sistema para estimulação optogenética simultânea e gravação eletrofisiológica.

Abstract

Durante a última década, a optogenética tornou-se uma ferramenta essencial para a investigação da sinalização neural devido à sua capacidade única de modulação ou monitoramento neural seletivo. Como tipos específicos de células neuronais podem ser geneticamente modificados para expressar proteínas de opsina, a optogenética permite estimulação óptica ou inibição dos neurônios selecionados. Houve vários avanços tecnológicos no sistema óptico para optogenética. Recentemente, foi proposto combinar o guia óptico de ondas para entrega de luz com gravação eletrofisiológica para monitorar simultaneamente as respostas neurais à estimulação ou inibição optogenética. Neste estudo, foi desenvolvido um conjunto de optrode implantável (fibras ópticas 2×2) com eletrodos multicanais incorporados.

Um diodo emissor de luz (LED) foi empregado como fonte de luz, e uma matriz de microluvas microfrágico foi integrada para fornecer energia de luz suficiente na ponta das fibras ópticas. O sistema de matriz optrode compreende a parte descartável e a parte reutilizável. A peça descartável possui fibras ópticas e eletrodos, enquanto a parte reutilizável possui o LED e circuitos eletrônicos para controle de luz e processamento de sinal neural. O novo desenho do sistema de matriz optrode implantável é introduzido no vídeo que acompanha, além do procedimento da cirurgia de implantação de optrode, estimulação de luz optogenética e gravação neural eletrofisiológica. Os resultados de experimentos in vivo mostraram com sucesso picos neurais bloqueados pelo tempo evocados pelos estímulos de luz dos neurônios excitatórios hipocampais de camundongos.

Introduction

Gravar e controlar a atividade neural é essencial para entender como o cérebro funciona em uma rede neural e em níveis celulares. Os métodos convencionais de gravação eletrofisiológica incluem o grampode remendo 1,2,3,4 utilizando um micropipette e gravação extracelular usando eletrodos microneurais 5,6,7,8. Como método de neuromodulação, a estimulação elétrica tem sido frequentemente usada para estimular diretamente uma região cerebral focal através da despolarização direta ou indireta das células neuronais. No entanto, o método elétrico não pode distinguir tipos de células neuronais para gravação ou estimulação porque as correntes elétricas se espalham em todas as direções.

Como tecnologia emergente, a optogenética iniciou uma nova era na compreensão de como funciona o sistema nervoso 9,10,11,12,13,14,15,16. A essência das técnicas optogenéticas é usar a luz para controlar a atividade de proteínas de opsina sensíveis à luz expressas por células geneticamente modificadas. Assim, a optogenética permite a modulação ou monitoramento sofisticado de células geneticamente selecionadas em circuitos neurais complicados14,17. O uso mais amplo da abordagem optogenética exigiu registro neural simultâneo para confirmar diretamente a neuromodulação óptica. Portanto, um dispositivo integrado com funções de controle de luz e gravação seria extremamente valioso 16,18,19,20,21,22,23,24,25.

Há limitações da estimulação optogenética convencional baseada em laser, que requer um sistema de entrega de luz volumoso e caro 26,27,28,29,30. Portanto, alguns grupos de pesquisa utilizaram sondas de silício baseadas em μLED para minimizar o tamanho do sistema de entrega de luz 31,32,33,34. No entanto, há risco de danos cerebrais térmicos causados pelo contato direto com μLEDs devido à baixa eficiência de conversão de energia dos LEDs. Guias de ondas leves, como fibras ópticas, SU-8 e oxírio de silício (SiON), foram aplicados para evitar danos térmicos 30,35,36,37,38,39. No entanto, essa estratégia também tem uma desvantagem devido à sua baixa eficiência de acoplamento entre fontes de luz e os guias de onda.

O conjunto de microlens foi introduzido anteriormente para aumentar a eficiência de acoplamento de luz entre LEDs e fibras ópticas40. Um sistema optrode foi desenvolvido com base em tecnologias de sistemas microeletromecânicos (MEMS) para estimulação óptica e gravação elétrica em uma microescala40. O conjunto de microlens entre um LED e fibras ópticas aumentou a eficiência da luz em 3,13 dB. Como mostrado na Figura 1, uma matriz de fibra óptica 2×2 está alinhada na matriz de microlens 4×4, e o LED está posicionado abaixo da matriz de microlens. As fibras ópticas 2×2 são montadas em vez de 4×4 para reduzir os danos cerebrais. Uma matriz de eletrodo de tungstênio é posicionada adjacente à matriz optrode usando silício através de orifícios para gravação eletrofisiológica (Figura 1B).

O sistema consiste em uma peça descartável superior e partes inferiores destacáveis. A parte descartável superior, que inclui o conjunto de fibra óptica, a matriz de microlens e a matriz de eletrodo de tungstênio, foi projetada para ser permanentemente implantada no cérebro para experimentos in vivo . A parte inferior inclui uma fonte de luz LED e uma linha de alimentação externa, que é facilmente removível e reutilizável para outro experimento animal. Uma tampa de plástico anexável protege a parte descartável quando a parte destacável é removida.

A viabilidade do sistema é verificada pela implantação nos cérebros de camundongos transgênicos que expressam channelrhodopsin-2 (ChR2) em Neurônios kinase II-positivos de proteína dependente de Ca2+/calmodulin (CaMKIIα::ChR2 mouse). Os eletrodos de gravação foram utilizados para registrar as atividades neurais de neurônios individuais durante a estimulação óptica dos neurônios.

Protocol

Os procedimentos cirúrgicos e de cuidados com animais foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) da Universidade da Mulher de Ewha (nº 20-029). 1. Preparação de uma matriz optrode (Figura 1 e Figura 2) Conecte fibras ópticas com a matriz de microlens. Remova o revestimento de passivação da fibra óptica e corte-a em pedaço…

Representative Results

O sistema optrode é fabricado com sucesso para fornecer energia de luz suficiente para ativar os neurônios alvo. O fino alinhamento dos eletrodos de tungstênio é alcançado através do silício microfrágico através dos orifícios. A intensidade da luz medida é de 3,6 mW/mm2 na ponta da fibra óptica quando a corrente de 50 mA é aplicada. Os microlens aumentaram a eficiência da luz em 3,13 dB. Devido à matriz de microlens, que melhora o acoplamento de luz, a corrente aplicada é aproximadamente metade…

Discussion

Verificou-se a viabilidade do sistema para estimulação optogenética simultânea e registro eletrofisiológico (Figura 6). Os grandes picos durante a estimulação da luz são artefatos fotoelétricos que ocorrem ao mesmo tempo que a estimulação da luz (Figura 6A). Isso é claro na visão ampliada da forma de onda no retângulo tracejado vermelho (Figura 6A). Como mostrado na Figura 6A, os artefatos…

Açıklamalar

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Esta pesquisa foi apoiada pelo Convergent Technology P&D Program for Human Augmentation através da National Research Foundation of Korea (NRF), financiada pelo Ministério da Ciência e TIC (NRF-2019M3C1B8090805), e apoiada por uma bolsa da Fundação Nacional de Pesquisa da Coreia (NRF) financiada pelo governo da Coreia (MSIT) (nº 2019R1A2C10888909). Agradecemos ao laboratório de Seung-Hee Lee no Departamento de Ciências Biológicas, KAIST, Daejeon, Coreia, por fornecer gentilmente os ratos transgênicos.

Materials

5-pin Connector NW3 HD127K 1.27 mm (.050") pitch
Bovie Fine Science Tools(F.S.T) 18010-00 High Temperature Cautery Kit
Data Acquisition Software Intan Technologies, LLC USB Interface Board software Work with the RHD USB Interface Board
Dental Cement Lang Dental Manufacturing Company, Inc. 1223CLR Use Jet Liquid and powder in jet denture repair package
Digital Manipulator Arm Stoelting Co. 51904/51906 Left, Right each Digital Manipulator Arm, 3-Axes, Add-On
Gel Foam Cutanplast Standard (70*50*10 mm) Sterile re-absorbable gelatin sponge with a haemostatic effect
Headstage Preamplifier Intan Technologies, LLC #C3314 RHD 16-Channel Recording Headstages
Heating Pad Stoelting Co. 53800R Stoelting Rodent Warmer X1 with Rat Heating Pad
LED OSLON GB CS8PM1.13 λ typ. 470 nm, Viewing angle 80 °, Forward voltage 2.85 V
MATLAB MathWorks, Inc. R2019a
Micro Clamp SURGIWAY 12-1002-04 Straight type, Serre-fine DIEFFENBACH droite 3.5 cm
Optical Fiber Thorlabs, Inc. FT200UMT 0.39 NA, Ø 200 µm Core Multimode Optical Fiber, High OH for 300 – 1200 nm
PFA-Coated Tungsten Wire A-M System Custom ordered Rod type, Ø 101.6 μm (.004")
Photodiode Thorlabs S121C
power meter Thorlabs Inc. PM100D
Precision cleaver FITEL S326 Fiber slicer tool
Prism GraphPad 5.01 version
Scalpel Feather™ #20 Scalpel blade with 100mm long Scalpel Handle
screw Nasa Korea stainless steel diameter: 1.2 mm, length: 3 mm
Silver Wire The Nilaco Corporation AG-401265 Ø 200 µm
Stereotaxic Fxrame Stoelting Co. 51500D Digital new standard stereotaxic, rat and mouse
suture ETHICON W9106 suture size: 4-0, length:75 cm, wire diameter: 4-0
Vaseline Unilever PLC Original 100% pure petroleum jelly
Wave_Clus N/A N/A https://github.com/csn-le/wave_clus

Referanslar

  1. Wang, Y., Liu, Y. Z., Wang, S. Y., Wang, Z. In vivo whole-cell recording with high success rate in anaesthetized and awake mammalian brains. Molecular Brain. 9 (1), 86 (2016).
  2. Segev, A., Garcia-Oscos, F., Kourrich, S. Whole-cell patch-clamp recordings in brain slices. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (112), e54024 (2016).
  3. Lee, D., Shtengel, G., Osborne, J. E., Lee, A. K. Anesthetized- and awake-patched whole-cell recordings in freely moving rats using UV-cured collar-based electrode stabilization. Nature Protocols. 9 (12), 2784-2795 (2014).
  4. Tao, C., Zhang, G., Xiong, Y., Zhou, Y. Functional dissection of synaptic circuits: in vivo patch-clamp recording in neuroscience. Frontiers in Neural Circuits. 9, 23 (2015).
  5. Henze, D. A., et al. Intracellular features predicted by extracellular recordings in the hippocampus in vivo. Journal of Neurophysiology. 84 (1), 390-400 (2000).
  6. Takahashi, S., Anzai, Y., Sakurai, Y. Automatic sorting for multi-neuronal activity recorded with tetrodes in the presence of overlapping spikes. Journal of Neurophysiology. 89 (4), 2245-2258 (2003).
  7. Buzsáki, G. Large-scale recording of neuronal ensembles. Nature Neuroscience. 7 (5), 446-451 (2004).
  8. Rossant, C., et al. Spike sorting for large, dense electrode arrays. Nature Neuroscience. 19 (4), 634-641 (2016).
  9. Balasubramaniam, S., et al. Wireless communications for optogenetics-based brain stimulation: present technology and future challenges. IEEE Communications Magazine. 56 (7), 218-224 (2018).
  10. Bedbrook, C. N., et al. Machine learning-guided channelrhodopsin engineering enables minimally invasive optogenetics. Nature Methods. 16 (11), 1176-1184 (2019).
  11. Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neural activity. Nature Neuroscience. 8 (9), 1263-1268 (2005).
  12. Deng, W., Goldys, E. M., Farnham, M. M., Pilowsky, P. M. Optogenetics, the intersection between physics and neuroscience: light stimulation of neurons in physiological conditions. American journal of physiology. Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 307 (11), 1292-1302 (2014).
  13. Fenno, L., Yizhar, O., Deisseroth, K. The development and application of optogenetics. Annual Review Neuroscience. 34, 389-412 (2011).
  14. Mahmoudi, P., Veladi, H., Pakdel, F. G. Optogenetics, tools and applications in neurobiology. Journal of Medical Signals and Sensors. 7 (2), 71-79 (2017).
  15. Sasaki, Y., et al. Near-infrared optogenetic genome engineering based on photon-upconversion hydrogels. Angewandte Chemie International Edition in English. 58 (49), 17827-17833 (2019).
  16. Zhang, Y., et al. Battery-free, lightweight, injectable microsystem for in vivo wireless pharmacology and optogenetics. Proceedings of National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (43), 21427-21437 (2019).
  17. Bernstein, J. G., Boyden, E. S. Optogenetic tools for analyzing the neural circuits of behavior. Trends in Cognitive Sciences. 15 (12), 592-600 (2011).
  18. Wang, J., et al. Integrated device for combined optical neuromodulation and electrical recording for chronic in vivo applications. Journal of Neural Engineering. 9 (1), 016001 (2012).
  19. Royer, S., et al. Multi-array silicon probes with integrated optical fibers: light-assisted perturbation and recording of local neural circuits in the behaving animal. European Journal of Neuroscience. 31 (12), 2279-2291 (2010).
  20. Zhang, J., et al. Integrated device for optical stimulation and spatiotemporal electrical recording of neural activity in light-sensitized brain tissue. Journal of Neural Engineering. 6 (5), 055007 (2009).
  21. Park, S. I., et al. Stretchable multichannel antennas in soft wireless optoelectronic implants for optogenetics. Proceedings of National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (50), 8169-8177 (2016).
  22. Kravitz, A. V., Owen, S. F., Kreitzer, A. C. Optogenetic identification of striatal projection neuron subtypes during in vivo recordings. Brain Research. 1511, 21-32 (2013).
  23. Aravanis, A. M., et al. An optical neural interface: in vivo control of rodent motor cortex with integrated fiberoptic and optogenetic technology. Journal of Neural Engineering. 4 (3), 143-156 (2007).
  24. Anikeeva, P., et al. Optetrode: a multichannel readout for optogenetic control in freely moving mice. Nature Neuroscience. 15 (1), 163-170 (2011).
  25. Obaid, S. N., et al. Multifunctional flexible biointerfaces for simultaneous colocalized optophysiology and electrophysiology. Advanced Functional Materials. 30 (24), 1910027 (2020).
  26. Wang, L., et al. An artefact-resist optrode with internal shielding structure for low-noise neural modulation. Journal of Neural Engineering. 17 (4), 046024 (2020).
  27. Shin, H., et al. Multifunctional multi-shank neural probe for investigating and modulating long-range neural circuits in vivo. Nature Communications. 10 (1), 3777 (2019).
  28. Kampasi, K., et al. Dual color optogenetic control of neural populations using low-noise, multishank optoelectrodes. Microsystem & Nanoengineering. 4, 10 (2018).
  29. Schwaerzle, M., Paul, O., Ruther, P. Compact silicon-based optrode with integrated laser diode chips, SU-8 waveguides and platinum electrodes for optogenetic applications. Journal of Micromechanics and Microengineering. 27 (6), 065004 (2017).
  30. Son, Y., et al. In vivo optical modulation of neural signals using monolithically integrated two-dimensional neural probe arrays. Scientific Reports. 5, 15466 (2015).
  31. Yasunaga, H., et al. Development of a neural probe integrated with high-efficiency MicroLEDs for in vivo application. Japanese Journal of Applied Physics. 60 (1), 016503 (2020).
  32. Kim, K., et al. Artifact-free and high-temporal-resolution in vivo opto-electrophysiology with microLED optoelectrodes. Nature Communications. 11 (1), 2063 (2020).
  33. Mendrela, A. E., et al. A high-resolution opto-electrophysiology system with a miniature integrated headstage. IEEE Transactions on Biomedical Circuits and Systems. 12 (5), 1065-1075 (2018).
  34. Scharf, R., et al. Depth-specific optogenetic control in vivo with a scalable, high-density muLED neural probe. Scientific Reports. 6, 28381 (2016).
  35. Oh, K., Sonsi, Y. -. A., Ha, S. Optogenetic stimulator with µLED-coupled optical fiber on flexile substrate via 3D printed mount. 2021 21st International Conference on Solid-State Sensors, Actuators and Microsystems (Transducers). , 1476-1479 (2021).
  36. McAlinden, N., et al. Multisite microLED optrode array for neural interfacing. Neurophotonics. 6 (3), 035010 (2019).
  37. Kwon, K. Y., Lee, H. M., Ghovanloo, M., Weber, A., Li, W. Design, fabrication, and packaging of an integrated, wirelessly-powered optrode array for optogenetics application. Frontiers in Systems Neuroscience. 9, 69 (2015).
  38. Bernstein, J. G., Allen, B. D., Guerra, A. A., Boyden, E. S. Processes for design, construction and utilisation of arrays of light-emitting diodes and light-emitting diode-coupled optical fibres for multi-site brain light delivery. Journal of Engineering. , (2015).
  39. Stark, E., Koos, T., Buzsaki, G. Diode probes for spatiotemporal optical control of multiple neurons in freely moving animals. Journal of Neurophysiology. 108 (1), 349-363 (2012).
  40. Jeon, S., et al. Implantable optrode array for optogenetic modulation and electrical neural recording. Micromachines. 12 (6), 725 (2021).
  41. Song, Y. H., et al. A neural circuit for auditory dominance over visual perception. Neuron. 93 (4), 940-954 (2017).
  42. Fiáth, R., et al. Slow insertion of silicon probes improves the quality of acute neuronal recordings. Scientific Reports. 9 (1), 111 (2019).
  43. Melchior, J. R., Ferris, M. J., Stuber, G. D., Riddle, D. R., Jones, S. R. Optogenetic versus electrical stimulation of dopamine terminals in the nucleus accumbens reveals local modulation of presynaptic release. Journal of Neurochemistry. 134 (5), 833-844 (2015).
  44. Quiroga, R. Q., Nadasdy, Z., Ben-Shaul, Y. Unsupervised spike detection and sorting with wavelets and superparamagnetic clustering. Neural Computation. 16 (8), 1661-1687 (2004).
  45. Chaure, F. J., Rey, H. G., Quian Quiroga, R. A novel and fully automatic spike-sorting implementation with variable number of features. Journal of Neurophysiology. 120 (4), 1859-1871 (2018).
  46. Casanova, F., Carney, P. R., Sarntinoranont, M. Effect of needle insertion speed on tissue injury, stress, and backflow distribution for convection-enhanced delivery in the rat brain. PLoS One. 9 (4), 94919 (2014).
  47. Iseri, E., Kuzum, D. Implantable optoelectronic probes for in vivo optogenetics. Journal of Neural Engineering. 14 (3), 031001 (2017).
  48. Arias-Gil, G., Ohl, F. W., Takagaki, K., Lippert, M. T. Measurement, modeling, and prediction of temperature rise due to optogenetic brain stimulation. Neurophotonics. 3 (4), 045007 (2016).
  49. Jeon, S., et al. Multi-wavelength light emitting diode-based disposable optrode array for in vivo optogenetic modulation. Journal of Biophotonics. 12 (5), 201800343 (2019).
  50. Korposh, S., James, S. W., Lee, S. -. W., Tatam, R. P. Tapered optical fibre sensors: current trends and future perspectives. Sensors. 19 (10), 2294 (2019).

Play Video

Bu Makaleden Alıntı Yapın
Lee, Y., Ryu, D., Jeon, S., Lee, Y., Cho, Y. K., Ji, C., Kim, Y., Jun, S. B. Optrode Array for Simultaneous Optogenetic Modulation and Electrical Neural Recording. J. Vis. Exp. (187), e63460, doi:10.3791/63460 (2022).

View Video