진급하려면 성장 콘이 외부 환경에 대한 견인력을 발휘해야 합니다. 견인력의 생성은 액틴 역학 및 클러치 커플링에 의존합니다. 본 연구는 성장 콘 발전을 위한 액틴 역학, 클러치 커플링 및 견인력을 분석하는 방법을 설명합니다.
기능 성 네트워크를 설정하려면 뉴런이 적절한 대상으로 마이그레이션한 다음 축축을 대상 셀쪽으로 확장해야 합니다. 이러한 프로세스는 중성염의 끝에 위치한 성장 콘의 발전에 따라 달라집니다. 축 사 성장 콘 그들의 로컬 미세 환경을 감지 하 고 사이토스켈레탈 역학 및 액틴 접착 커플링 (클러치 커플링)을 변조 하 여 원동력을 생성 합니다. 연구의 수십 년 지침 분자의 식별으로 이어졌다, 그들의 수용 체, 그리고 하류 신호 폭포 신경 이동 및 축 하 지침을 조절하기 위한 폭포; 그러나, 성장 원뿔 사전및 탐색을 구동하는 힘을 생성하는 데 필요한 분자 기계는 단지 해명되기 시작했다. 뉴런 성장 콘의 선두 가장자리에서 액틴 필라멘트는 역행 흐름을 거치며, 이는 액틴 중합화 및 actomyosin 수축에 의해 구동됩니다. F-액틴 역행 흐름과 접착제 기판 사이의 클러치 결합은 성장 원뿔 발전을 위한 견인력을 생성합니다. 본 연구는 단일 반점 이미징에 의한 F-액틴 역행 흐름을 모니터링하기 위한 상세한 프로토콜을 설명합니다. 중요한 것은, F-actin 마커 Lifeact와 결합될 때, 이 기술은 F-actin 중합률 및 2) F-액틴 역행 흐름과 접착제 기판 사이의 클러치 커플링 효율을 정량화할 수 있다. 둘 다 성장 원뿔 사전 및 탐색을 위한 힘을 생성하는 데 중요한 변수입니다. 또한, 본 연구는 성장 콘에 의해 생성된 3) 견인력을 정량화할 수 있는 견인력 현미경 검사법의 상세한 프로토콜을 기술한다. 따라서, 단일 반점 이미징 및 견인력 현미경 검사법의 분석을 결합함으로써, 조사자들은 성장 콘 의 전진 및 탐색의 근간분자 역학을 모니터링할 수 있다.
개발 척추 동물 뇌에서, 뉴런은 정교하게 조직 된 마이그레이션을 겪고 기능적 신경 네트워크를 확립하기 위해 적절한 시냅스 파트너를 향해 축축을 투영1,2,3. 중성염 의 끝에 위치한 감각 및 운동 구조인 성장 콘은 뉴런 마이그레이션과 축삭의 속도와 방향을 결정3,4,5. 뉴런은 단단히 포장 된 환경에 둘러싸여 있기 때문에 성장 콘은 앞으로 이동하기 위해 자신의 환경에 대한 힘을 발휘해야합니다6,7. 뉴런 마이그레이션 및 축 하 지침의 기본 메커니즘을 이해 하려면, 성장 콘 사전에 대 한 분자 역학의 분석 필수적이다.
수십 년간의 분석에 따르면 성장 콘 발전을 촉진하는 견인력이 ‘클러치’ 메커니즘에 의해 생성되는 것으로 나타났습니다. 이 메커니즘은 축 성장 콘뿐만 아니라 뉴런마이그레이션의 선도적 인 과정 성장 원뿔에서뿐만 아니라 기능하는 것으로 생각된다8,9,10,11,12. 즉, 성장 콘의 액틴 필라멘트(F-actins)는 최첨단에서 중합하고 근교로 비합합하여 최첨단 멤브레인13,14,15를 밀어냅니다. 그 결과, actomyosin 수축과 함께, 역행 흐름7,11,16,17,18,19,20,21이라고 불리는 F-액틴의 후방 이동을 유도한다. 클러치 및 세포 접착 분자는 F-actin 역행 흐름과 접착 기판 사이의 기계적 결합을 중재하고 F-액틴 흐름의 힘을 기판에 전달하여 성장 콘 어드밴스7,8,9,11,12,22를 위한 견인력을 생성합니다. . 동시에, 액틴 기판 커플링은 F-액틴 유량 속도를 감소시키고 액틴 중합화를 힘으로 변환하여 최첨단 멤브레인9,10을 돌출한다.
축 축 성장 콘 은 로컬 화학 단서를 감지 하 고 성장 콘 탐색에 대 한 방향 원동력으로 변환 3,23,24,25. 예를 들어, 축삭 유도 분자 넷린-1은 대장암(DCC)에서 삭제된 수용체를 자극하고, 로 구아노신 삼위산염(GTP)-결합 단백질 세포 분열 대조단백질 42(Cdc42) 및 Ras 관련 C3 보툴리눔 독소 기판 1(Rac1) 및 이들의 하류 박시(21)를 활성화한다. Cdc42 및 Rac1은 1) 액틴 중합화를 촉진하고, Pak1은 클러치 분자 촬영122,26을 인광한다. Shootin1은 액틴 결합 단백질 cortactin27을 통해 F-액틴 역행 흐름과 상호 작용합니다. Shootin1은 또한 L1 세포 접착 분자 (L1-CAM)20,24와 상호 작용합니다. Shootin1 인산화는 코락틴과 L1-CAM의 결합 친화성을 증가시키고, shootin1-매개 2) 클러치 커플링24,27을 향상시킵니다. 성장 콘 내에서, 액틴 중합 및 클러치 커플링의 비대칭 활성화는 넷린-1 소스의 측면에 대한 견인력 증가 3) 성장 콘 선삭에 대한 방향 구동력을 생성한다(도 1)24. 신경 이동 및 축 하 지침에 관하여 지난 수십 년 동안 집중적인 연구는 지도 분자의 이해를 향상 시켰다, 그들의 수용 체, 그리고 관련 다운 스트림 신호 폭포2,10,28,29,30. 그러나, 성장 콘 어드밴스에 대한 힘을 생성하는 분자 기계는 단지 해명되기 시작했다; 이는 메카노생물학적 분석을 위한 프로토콜의 제한된 사용에 기인할 수 있다.
본 연구는 단일 반점 화상 진찰16,18에 의하여 F-actin 역행 흐름을 감시하기 위한 상세한 프로토콜을 기술합니다. F-actin 역행 흐름의 모니터링은 초해상도 현미경 검사법, 방적 디스크 공초점 현미경 및 총 간섭 반사 형광(TIRF) 현미경 검사25,31,32,32,34,35,36,37,37,38을 사용하여 광범위하게 수행되었습니다. . 그러나 본 연구에서 프로토콜은 표준 형광 현미경을 사용하므로 쉽게 채택할 수 11,16,18,20,22,22,23,27,27,39,40,41,42. Lifeact43에 의한 F-액틴 라벨링과 결합하면, 단일 반점 이미징은 액틴 중합률과 F-액틴 역행 흐름과 접착제 기판 사이의 클러치 커플링 효율의 정량화를 허용한다39,42. 본 연구는 형광 비드 에 내장 된 폴리 아크릴아미드 (PAA) gel11,22,23,27,27,39,41,42,44를 사용하여 견인력 현미경 검사법의 상세한 프로토콜을 더 설명합니다. 이 방법은 힘 유도 비드 움직임을 모니터링하여 성장 콘 하에서 견인력을 감지하고 정량화합니다44,45. 오픈 소스 견인력 분석 코드가 제공되며 성장 콘 마이그레이션 중에 견인력을 정량화하는 방법을 자세히 설명합니다. 단일 반점 이미징 및 견인력 현미경 검사법의 도움으로 성장 원뿔 이동 및 탐색의 근간이되는 분자 역학을 이해하는 것이 촉진될 것입니다. 이러한 기술은 또한 학습 및 메모리42에서 중요한 것으로 알려져 있는 수지상 척추 확대의 근본적인 분자 역학을 분석하기 위해 적용됩니다.
이 연구에서 설명된 프로토콜은 모든 실험실, 기관 및 대학에서 일상적으로 발견되는 시판되는 재료와 현미경 장비를 사용합니다. 따라서, 조사원은 그들의 연구 결과에서 현재단 단 하나 반점 화상 진찰 및 견인력 현미경 검사를 쉽게 채택할 수 있습니다.
반점 이미징은 액틴 중합및 클러치 커플링을 분석할 수 있습니다. 또한, 반점 이미징은 F-액틴 역행 흐름과 상호 작용하는 shootin1 및 cortactin과 같은 클러치 분자의 역행 흐름을 모니터링할 수 있습니다. TIRF 현미경을 이용하여, 세포 접착 분자 L1-CAM의 역행 흐름도 모니터링될 수 있다23,41; L1-CAM은 클러치 커플링 효율을 반영하는 그립 및 슬립 동작을 겪습니다23,41. 본 연구는 반점 이미징을 위한 TMR-HaloTag 시스템을 채택하지만 EGFP 및 단황 적색 형광 단백질과 같은 다른 형광 단백질도 분석16,18,20,23,24,27,39에서 사용할 수 있습니다. 액틴 반점 시각화를 위한 필수 사항은 형광 액틴의 낮은 발현 수준과 최소 영역의 조명(그림 2)입니다. 이 프로토콜에서는 Lifeact 및 HaloTag 액틴 신호가 순차적으로 획득됩니다. 액틴 역행 흐름이 상대적으로 느리기 때문에(4.5± 0.1 μm/min)24, F-액틴 역행 흐름 및 액틴 중합화 분석은 다른 형광 채널(~1s 간격)의 순차적 이미지 수집에 영향을 받지 않습니다. Lifeact는 널리 사용되는 F-액틴 마커이지만 액틴 결합 단백질47과 경쟁할 수 있습니다. 더 중요한 것은 Lifeact가 액틴 역학을 변화시켜 F-액틴 구조와 세포 형태에 영향을 미칠 수 있습니다47,48,49.
견인력 현미경 검사법은 성장 콘 발전을 유도하는 힘을 감지할 수 있습니다. 세포 외 매트릭스 내에 뉴런을 장착함으로써, 조사관은 또한 반 3D 환경에서 생성 된 힘을 분석 할 수있다11. 고배율 이미징은 성장 원뿔이 약한 견인력을 생성하기 때문에 견인력의 정확한 정량화에 중요합니다7. 나노기둥 또는 스트레스에 민감한 바이오 센서를 이용한 다른 방법도 견인력을 측정하는 데 사용되지만, PAA 겔 계법은 적응력이 뛰어나고 아크릴아미드및 비스 아크릴라미드의 농도를 변화시킴으로써 기판 강성을 조정할 수 있다41,44,52. 본 프로토콜에서 PAA 젤은 아크릴아미드 3.75% 및 0.03% 비스 아크릴아미드의 최종 농도로 제조된다; 영의 계수는 ~270 Pa22이며 이 강성은 뇌 조직의 범위 내에 있습니다 (100-10,000 Pa)53,54,55. PAA 젤 (~100 μm)의 두께로 인해 이 방법은 현미경 검사중에 고배율 렌즈의 사용을 제한합니다. 높은 배율 이미지를 얻으려면, 조사관은 레이저 스캐닝 공초점 현미경에서 줌 기능을 사용해야 합니다.
결론적으로, 현재반점 이미징 및 견인력 현미경 검사는 힘 세대의 주요 사건의 정량적 분석을 가능하게 한다. 이 정보는 성장 콘 발전과 탐색의 기초가 되는 메커니즘에 대한 이해를 향상시키는 데 매우 중요합니다.
The authors have nothing to disclose.
이 연구는 보조금 번호 21gm081001h00005 (N.I.I.에서 AMED에 의해 부분적으로 지원되었습니다. JSPS KAKENHI (JP19H03223, N.I.) 및 JSPS 그랜트 -에 이-초기 경력 과학자에 대 한 원조 (JP19K16258, T.M.), 불치성 질환에 대 한 오사카 의학 연구 재단 (T.M.), 그리고 NAIST 차세대 학제 간 연구 프로젝트 (Y.S.).
0.5% trypan blue stain solution | Nacalai | 29853-34 | |
3-aminopropyltrimethyoxysilane | Sigma | 281778-100ML | |
Acrylamide monomer | Nacalai | 00809-85 | |
Ammonium persulphate | Cytiva | 17-1311-1 | |
Axio Observer Z1 | Zeiss | 431007-9902-000 | Epi-fluorescence microscope (single speckle imaging) |
B-27 supplement (50x) | Thermo Fisher Scientific | 17504-044 | |
Bovine serum albmine | Sigma | A7906-10G | |
C-Apochromat 63x/1.2 W Corr | Zeiss | 421787-9970-799 | Objective lens (traction force microscopy) |
Coverslip (diameter 18 mm) | Matsunami | C018001 | |
D-glucose | Nacalai | 16806-25 | |
DNaseI | Sigma | DN25-100MG | |
Fetal bovine serum | Thermo Fisher Scientific | 10270-106 | |
Fiji | Open source software package | https://imagej.net/software/fiji/ | |
FluoSpheres carboxylate-modified 0.2 mm, red (580/605), 2% solid | Thermo Fisher Scientific | F8810 | carboxylate-modified microspheres |
Glass bottom dish (14 mm diameter) | Matsunami | D1130H | |
Glass bottom dish (27 mm diameter) | Matsunami | D1140H | |
Glutaraldehyde solution | Sigma | G5882-10X10ML | |
HaloTag TMR ligand | Promega | G8251 | |
HBO103 W/2 | Osram | 4050300382128 | Mercury lamp (single speckle imaging) |
Image Processing Toolbox | MathWork | https://www.mathworks.com/products/image.html | |
Laminin solution from mouse EHS tumor | Wako | 120-05751 | |
Leibovitz’s L-15 medium | Thermo Fisher Scientific | 11415064 | |
L-glutamine | Nacalai | 16919-42 | |
LSM710 | Zeiss | N/A | Conforcal laser microscope (traction force microscopy) |
MATLAB2018a | MathWork | https://www.mathworks.com/products/new_products/release2018a.html | |
Mouse C57BL/6 | Japan SLC | N/A | |
Mouse neuron nucleofector kit | Lonza | VPG-1001 | |
N,N,N’,N’-tetramethylethylenediamine (TEMED) | Nacalai | 33401-72 | |
N,N’-methylenebisacrylamide | Nacalai | 22402-02 | |
Neurobasal medium | Thermo Fisher Scientific | 21103-049 | |
Nucleofector I | Amaxa | AAD-1001 | Electroporation apparatus |
ORCA Flash 4.0 V2 | Hamamatsu | C11440-22CU | CMOS camera (single speckle imaging) |
Papain | Nacalai | 26036-34 | |
Parallel Computing Toolbox | MathWork | https://www.mathworks.com/products/parallel-computing.html | |
pEGFP-C1 | Clontech | 1528177 | |
Penicillin-streptomycin (100x) | Nacalai Tesque | 26253-84 | |
pFN21A-HaloTag-actin | (Minegishi et al., 2018) | N/A | |
Phosphate buffered saline (PBS) pH 7.4 (10x) | Thermo Fisher Scientific | 70011-044 | |
Plan-Apochromat 100x/1.4 Oil | Zeiss | 420790-9901-000 | Objective lens (single speckle imaging) |
pmNeonGreen-N1-Lifeact | (Kastian et al., 2021) | N/A | |
Poly-D-lysine hydrobromide | Sigma | P6407-5MG | |
Slulfo-SAMPHA | Thermo Fisher Scientific | 22589 | |
Sodium dodecyl sulfate | Nacalai | 08933-05 | |
Sodium hydrate (NaOH) | Nacalai | 31511-05 | |
Steel ball | Sako tekkou | N/A | Microshpere to determin PAA gel rigidity. 0.6 mm diameter, 7.87 g/cm3. |
ZEN2009 | Zeiss | https://www.zeiss.com/microscopy/us/products/microscope-software/zen.html#introduction | Image acquisition software (traction force microscopy) |
ZEN2012 | Zeiss | https://www.zeiss.com/microscopy/us/products/microscope-software/zen.html#introduction | Image acquisition software (single speckle imaging) |