本文提供了对成年 果蝇 造成穿透性创伤性脑损伤(PTBI)的详细方案,并检查由此产生的神经发生。
对疾病或损伤作出反应的神经发生的分子和细胞机制尚不清楚。然而,了解这些机制对于开发神经再生疗法至关重要。 果蝇黑色素胃 是神经发育研究的领先模型,但历史上尚未被用来研究成人大脑再生。这主要是因为成人大脑表现出非常低的有丝分裂活动。尽管如此,对成年 果蝇 中枢脑的穿透性创伤性脑损伤(PTBI)会触发新神经元和新神经胶质细胞的产生。 果蝇 中可用的强大遗传工具与这里描述的简单但严格的损伤方案相结合,现在使成年 果蝇 大脑成为神经再生研究的强大模型。此处提供了(1)成人中枢脑穿透伤和(2)解剖,免疫组化和损伤后成像的详细说明。这些方案产生高度可重复的结果,并将促进额外的研究,以剖析神经再生背后的机制。
大脑和神经系统的损害是全世界死亡和残疾的主要原因。每年约有 150 万美国人遭受创伤性脑损伤 (TBI)1,而仅在美国,估计就有 600 万人患有神经退行性疾病,如帕金森病和阿尔茨海默病2。疾病和大脑损伤都可能导致神经变性,导致感觉、认知和运动缺陷3。由于大脑复杂的生理学,开发人脑修复的治疗策略一直很困难。黑 腹果蝇 等模式生物为识别神经变性的基本机制和潜在的治疗靶点4提供了一个简单的系统。
一个多世纪以来,果蝇 果蝇黑腹果 蝇一直是一种强大的模式生物,推动了遗传学、发育生物学和神经科学领域的发展5,6。 果蝇 大脑仅包含约 90,000 个神经元7,比普通人类大脑少 100 万倍8,但它们有许多相似之处。人类和苍蝇的大脑都利用神经递质GABA,谷氨酸,乙酰胆碱以及生物胺多巴胺和血清素9。 果蝇 和人类神经元的功能也类似,具有共享的突触结构和相似的神经细胞类型10。 果蝇 较小的大脑尺寸和先进遗传学技术的可用性,结合 果蝇 和哺乳动物之间分子,细胞和生理机制的保守,使 果蝇 研究人员能够提出在哺乳动物模型中不切实际或难以回答的问题。
我们目前对 果蝇成人神经发生的理解,无论是在体内平衡期间还是在损伤后,仍然有限。关于正常发育过程中的神经发生,人们已经知道更多。例如,神经元和神经胶质细胞是在前体细胞发育过程中产生的,称为神经母细胞10,11。至少有三种不同类型的神经母细胞在中枢脑中被区分出来。I型和II型谱系神经母细胞在蛹形成后约20-30小时退出细胞周期12。相比之下,蘑菇体神经母细胞是最后终止细胞分裂的,并且在蛹形成后约85-90小时 通过 收割者依赖性凋亡来终止细胞分裂13。在闭合后,成年 果蝇 大脑的分裂细胞很少(~1个细胞/脑),主要是神经胶质细胞14。成体视叶具有能够进行神经发生的缓慢循环的神经母细胞15,而成年中枢脑则没有已知的神经母细胞。神经祖细胞的稀缺性和有限的细胞增殖与成年哺乳动物大脑的情况非常相似,突显了 果蝇 中成虫神经发生机制对人类的潜在相关性。
在损伤后发现成年 果蝇 视叶中成人神经发生水平低15 ,导致成人 果蝇 中枢脑也可能能够进行成人神经发生16的假设。该协议描述了在成年 果蝇 中创建一个严格的,可重复的中枢脑损伤模型,可用于研究成人中枢脑的神经发生。鉴于人类和 果蝇 大脑结构和功能之间的相似性,这些发现可能导致确定受伤和患病人脑中治疗性神经发生的关键靶标。
虽然之前已经描述了成年果蝇大脑的穿透性损伤15,17,18,但这些损伤集中在视叶而不是中枢脑。此外,迄今缺乏关于如何实施伤害的详细说明。该协议描述了一种对成年 果蝇 中枢脑进行穿透性损伤的模型,该模型再现了PTBI后成人神经发生的统计学显着证据。
这种PTBI方案的可重复性部分是由于蘑菇体作为损伤靶区。蘑菇体很大,由约2200个神经元组成,具有复杂的树突和轴突乔木,形成大型且高度刻板的阵列18。蘑菇体神经元的细胞体位于大脑表面附近,可以使用绿色荧光蛋白(GFP)的表达通过头部角质层进行可视化 (图1C)。 蘑菇体前体是发育过程中最后经历细胞凋亡的神经干细胞13,12,19。因此,许多蘑菇体神经元在eclosion时非常年轻。这导致了一种假设,即蘑菇体可能比其他大脑区域具有更多的有丝分裂潜力16。此外,蘑菇体对学习和记忆至关重要18。这允许人们询问PTBI触发的神经发生是否会导致功能恢复。
其他有助于结果可重复性的因素包括使用基因型一致的异交苍蝇,每次在同一方向上进行杂交,精确控制饲养和老化温度,以及分别分析雄性和雌性。使用来自外杂交的F1苍蝇可以降低分析大脑纯合子自发突变的可能性。 y[1] w[1]的标准十字;UAS-mCD8-GFP;;OK107-GAL4 成年雌性到 y[1] w[1] 成年雄蝇导致基因型 y[1]w[1]的F1后代;UAS-mCD8-GFP/+;;OK107-GAL4/+. OK107-GAL4 在蘑菇体的所有内在神经元中表达,并驱动膜结合报告 器UAS-mCD8-GFP 的表达,允许可视化蘑菇体及其投影。对于永久双胞胎十字架,十字架必须始终保持在17°C,以保持血统追踪系统关闭。这确保了在发育过程中没有分裂细胞被标记,并且只有成人出生的神经元和神经胶质细胞被标记。为此,飞行室也可以保持在17°C。 虽然对永久双胞胎系统的初始描述15 建议在18°C下饲养苍蝇,但这可能导致显着的背景标记。
为了保持一致性,还建议在执行PTBI时将控制未受伤的苍蝇保持在CO2 垫上。这确保了两组苍蝇具有相同的麻醉暴露。此外,希望可重复性完全穿透头部。但是,必须注意不要将销尖弯曲到垫子上,使其无法用于将来的伤害。对于熟练的从业者来说,PTBI苍蝇几乎没有意外伤害。尽管如此,在受伤期间用力按压胸部以稳定苍蝇可能是致命的。评估意外伤害程度的一种方法是量化受伤后24小时PTBI苍蝇的死亡率。对于单侧受伤的苍蝇,对于初学者来说,这可能是50%或更高。因此,为了确保观察到的结果是由于PTBI而不是意外伤害,建议初学者在几周内每天对约20只苍蝇进行PTBI,并且在24小时死亡率始终<10%之前不要分析产生的大脑。
为了量化中枢脑PTBI刺激的增殖量,可以采用抗磷酸组氨酸H3(PH3)免疫染色和5-乙炔基-2′-脱氧尿苷(EdU)掺入。抗PH3在中期之前和整个中期标记细胞,将检测限制在只有一小部分活跃分裂的细胞。因此,抗PH3染色只能提供部分增殖的一瞥。EdU是一种胸腺嘧啶类似物,可以掺入新合成的DNA中。通过在受伤前后喂养苍蝇EdU,可以更全面地了解受伤后正在分裂或分裂的细胞。任何分裂的细胞都被永久标记的事实对于识别缓慢循环的细胞和测定初始增殖后细胞的存活率都很有帮助。由于不明原因,但可能是由于血脑屏障的通透性有限,EdU标记效率低下,并且未充分报告成人大脑中的细胞增殖。在PTBI后24小时,对照和实验大脑中PH3 +和EdU +细胞的数量相似,并且观察到永久双胞胎克隆中只有一部分新细胞含有EdU16,这证明了这一点。为了最大限度地标记,必须用EdU预先喂养苍蝇,因为受伤的苍蝇在PTBI后的几个小时内不会恢复喂养。通过在EdU溶液中添加食用色素并通过腹部角质层监测肠道中染料的量来评估喂养16。
需要注意的是,虽然我们在步骤4中提供了脑部解剖方案,但可以使用替代技术。其中一些在以前发布的协议中可用20,21,22。 Drosophila melanogaster 提供了一种低成本的模型,具有强大的遗传和分子工具,可用于研究多种组织再生的机制,包括肠道和神经系统的组成部分。这里概述了一种新颖且可重复的损伤模型,可用于研究对脑损伤的反应。使用这些协议获得的数据支持这样一种观点,即成年 果蝇 中枢大脑保留了增殖能力,从而产生新的神经元来应对损伤。这些观察结果需要进一步研究成人神经发生的程度及其潜在的分子机制。一旦在这个系统中确定了参与神经再生的成分,我们就可以将我们对成年 果蝇 神经发生的知识转化为人类。
The authors have nothing to disclose.
我们感谢Stacey Rimkus和Becky Katzenberger的技术援助,并感谢Eduardo Moreno分享永久双胞胎股票。我们要感谢Barry Ganetzky和David Wassarman的热烈讨论,这些讨论无疑改善了科学,并感谢Kent Mok,Cayla Guerra和Bailey Spiegelberg对实验室的贡献。FasII抗体由Corey Goodman开发,并从发育研究杂交瘤库获得,该库由NIH的NICHD创建,并在爱荷华大学生物系,爱荷华市,IA 52242维护。本研究中使用的大多数 果蝇 菌株都是从布卢明顿果蝇库存中心(BDSC;NIH P40OD018537).这项工作得到了NIH T32 GM007133(KLC)的支持;美国国立卫生研究院NS090190 (GBF);美国国立卫生研究院NS102698 (GBF);威斯康星大学研究生院(GBF);以及威斯康星大学麦迪逊分校科学与工程女性领导学院(WISELI)(GBF)。
#11 disposable scalpels | Santa Cruz Biotechnology | sc-395923 | used for separating Drosophila heads from trunks prior to brain dissection |
150 mm diameter black Sylgard dishes | Dow | 1696157 | made in the laboratory with reagents from Dow; used for brain dissection |
18 mm coverslips | any | for mounting brains on microscope slides | |
4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride (DAPI) | ThermoFisher | D1306 | for immunohistochemistry |
70% Ethanol | made from 95% ethanol sourced variously | ||
anti-mouse Cy5 | Jackson ImmunoResearch | 715-175-151 | for immunohistochemistry |
anti-rabbit 568 | ThermoFisher | A11036 | for immunohistochemistry |
bovine serum albumin (BSA) | SIgma Aldrich | A7030 | for immunohistochemisty |
Clear nail polish | any | for sealing coverslips | |
Click-It EdU labeling kit | InVitrogen | C10640 | to detect newly synthesized DNA |
CO2 bubbler | Genesee Scientific | 59-181 | for anesthesia |
CO2 pad | Genesee Scientific | 59-114 | for anesthesia |
CO2 regulator and supply | any | for anesthesia | |
Confocal microscope | any | for imaging fixed, stained and mounted brains | |
cotton plugs | Genesee Scientific | 51-101 | for EdU labeling |
Drosophila vials | Genesee Scientific | 32-109 | for EdU labeling |
Fix buffer (Pipes, EGTA, Magnesium; PEM) | components sourced from various companies | for fixing adult brains; 100 mM piperazine-N,N’-bis(2-ethanesulfonic acid) [PIPES], 1 mM EGTA, 1 mM MgSO4, pH 7.0 | |
Formaldehyde | Sigma Aldrich | 252549 | for fixing adult brains, added to PEM |
Grade 3 round Whatman filters, 23 mm round | Tisch Scientific | 1003-323 | for EdU labeling |
Microfuge tubes | any | for fixing and staining reactions and for storing Minutien pins | |
Microscope slides | any | for mounting brains | |
Minutien pins | Fine Science Tools | 26002-10 | for brain injury; 12.5 μm diameter tip and 100 μm diameter rod |
mouse anti-Fasiclin II | Developmental Studies Hybridoma Bank | 1D4-s | for immunohistochemistry |
NIGHTSEA stereo microscope fluorescence adaptor | Electron Microscopy Sciences | SFA-GR | fluorescence setup for dissecting microscope |
P20, P200 and P1000 pipettors and tips | any | for measuring solutions | |
phosphate buffered saliine (PBS) | components sourced from various companies | for dissecting brains and making immunohistochemistry blocking and washing solutions; 100 mM of K2HPO4, 140 mM of NaCl, pH 7.0 | |
phosphate buffered saline with 0.1% Triton X-100 (PT) | components sourced from various companies | for washing dissected brains | |
phosphate buffered saline with 0.1% Triton X-100 + 2% bovine serum albumin (PBT) | components sourced from various companies | blocking solution for immunohistochemistry and for diluting antibodies | |
rabbit anti-PH3 | Santa Cruz Biotechnology, Inc | sc-8656-R | for immunohistochemistry |
Reinforcement labels | Avery | 5721 | to maintain space between the microscope slide and the coverslip |
Size 0 paintbrushes | any | to manipulate and stabilize adult Drosophila during injury | |
Triton X-100 | Sigma Aldrich | 93443 | |
Two pair of #5 watchmakers forceps | Fine Science Tools | 11255-20 | used to hold the Minutien pins and for brain dissections |
Vectashield | Vector Laboratories | H-1000 | mounting medium for microscope slides |