توفر هذه المقالة بروتوكولات مفصلة لإلحاق اختراق إصابات الدماغ الرضية (PTBI) للبالغين Drosophila وفحص التكوين العصبي الناتج.
الآليات الجزيئية والخلوية الكامنة وراء تكوين الأعصاب استجابة للمرض أو الإصابة ليست مفهومة جيدا. ومع ذلك ، فإن فهم هذه الآليات أمر بالغ الأهمية لتطوير العلاجات العصبية التجديدية. Drosophila melanogaster هو نموذج رائد لدراسات التطور العصبي ولكن تاريخيا لم يتم استغلالها للتحقيق في تجديد الدماغ الكبار. ويرجع ذلك في المقام الأول إلى أن الدماغ البالغ يظهر نشاطا متزمنا منخفضا جدا. ومع ذلك، اختراق إصابات الدماغ الرضية (PTBI) إلى الدماغ المركزي Drosophila الكبار يؤدي إلى توليد خلايا عصبية جديدة وجليا جديدة. الأدوات الوراثية القوية المتاحة في Drosophila جنبا إلى جنب مع بروتوكول الإصابة بسيطة ولكنها صارمة وصفها هنا الآن جعل الدماغ Drosophila الكبار نموذجا قويا لأبحاث التجديد العصبي. وفيما يلي تعليمات مفصلة عن (1) اختراق إصابات الدماغ المركزي الكبار و (2) تشريح، الكيمياء المناعية، والتصوير بعد الإصابة. هذه البروتوكولات تسفر عن نتائج قابلة للاستنساخ للغاية، وسوف تسهل دراسات إضافية لتشريح الآليات الكامنة وراء التجديد العصبي.
الأضرار التي لحقت الدماغ والجهاز العصبي هو السبب الرئيسي للوفاة والعجز في جميع أنحاء العالم. يعاني ما يقرب من 1.5 مليون أمريكي من إصابات الدماغ الرضية (TBI) كل عام1 ، في حين يعاني ما يقدر ب 6 ملايين شخص في الولايات المتحدة وحدها من أمراض تنكسية عصبية ، مثل مرض باركنسون ومرض الزهايمر2. يمكن أن يسبب كل من المرض وإصابة الدماغ انحطاطا عصبيا ، مما يؤدي إلى عيوب حسية ومعرفية ومحركات3. كان تطوير استراتيجيات علاجية لإصلاح الدماغ البشري صعبا بسبب فسيولوجيا الدماغ المعقدة. توفر الكائنات الحية النموذجية مثل Drosophila melanogaster نظاما بسيطا لتحديد الآليات الأساسية الكامنة وراء التنكس العصبي والأهداف العلاجية المحتملة4.
ذبابة الفاكهة Drosophila melanogaster كان كائنا نموذجيا قويا لأكثر من قرن من الزمان ، والنهوض بمجالات علم الوراثة ، وعلم الأحياء التنموي ، وعلم الأعصاب5،6. الدماغ Drosophila يضم فقط ~ 90،000 neurons7، مليون مرة أقل من متوسط الدماغ البشري8، ولكن لديهم العديد من أوجه التشابه. كل من الإنسان ويطير العقول الاستفادة من الناقلات العصبية GABA, الغلوتامات, أستيل, والأمينات الحيوية الدوبامين والسيروتونين9. يعمل Drosophila والخلايا العصبية البشرية أيضا بشكل مماثل ، مع بنية متشابكة مشتركة وأنواع الخلايا العصبية المماثلة10. حجم الدماغ الأصغر من Drosophila وتوافر تقنيات علم الوراثة المتقدمة ، بالإضافة إلى الحفاظ على الآليات الجزيئية والخلوية والفسيولوجية بين Drosophila والثدييات ، يسمح للباحثين Drosophila بطرح أسئلة غير عملية أو يصعب الإجابة عليها في نماذج الثدييات.
فهمنا الحالي لنشأة الأعصاب للبالغين في دروسوفيلا، سواء أثناء الإصابة المنزلية أو بعدها، لا يزال محدودا. يعرف المزيد عن تكوين الأعصاب أثناء النمو الطبيعي. على سبيل المثال، يتم إنشاء الخلايا العصبية وغليا أثناء التنمية من الخلايا السليفة، ودعا neuroblasts10،11. وقد تم تمييز ما لا يقل عن ثلاثة أنواع مختلفة من الخلايا العصبية في الدماغ المركزي. كل من النوع الأول والنوع الثاني النسب neuroblasts الخروج من دورة الخلية ~ 20-30 ساعة بعد تشكيل puparium12. في المقابل، فإن الأروميات العصبية الجسم الفطر هي آخر لإنهاء انقسام الخلية والقيام بذلك عن طريق موت الخلايا المبرمج التي تعتمد على ريبر ~ 85-90 ساعة بعد تشكيل puparium13. بعد انهيار الدماغ ، والدماغ Drosophila الكبار لديها عدد قليل من الخلايا الفاصلة (~ 1 الخلية / الدماغ) ، في الغالب glia14. تمتلك الفصوص البصرية البالغة الأرومات العصبية القادرة على تكوين الأعصاب ببطء15 ، في حين أن الدماغ المركزي البالغ ليس لديه أرومة عصبية معروفة. ندرة السلف العصبية وانتشار الخلايا المحدودة يشبه بقوة الوضع في دماغ الثدييات البالغة ، مما يؤكد على الأهمية المحتملة لآليات تكوين الأعصاب للبالغين في دروسوفيلا للبشر.
أدى اكتشاف مستويات منخفضة من تكوين الأعصاب للبالغين في الفصوص البصرية Drosophila البالغة بعد الإصابة15 إلى فرضية أن الدماغ المركزي Drosophila البالغ قد يكون قادرا أيضا على تكوين الأعصاب البالغ16. يصف هذا البروتوكول إنشاء نموذج صارم وقابل للاستنساخ لإصابة الدماغ المركزية في Drosophila البالغة التي يمكن استخدامها للتحقيق في تكوين الأعصاب في الدماغ المركزي للبالغين. وبالنظر إلى أوجه التشابه بين بنية الدماغ البشرية وبنية الدماغ الدروزوفيلا ووظيفتها، يمكن أن تؤدي هذه الاكتشافات إلى تحديد أهداف حاسمة لنشأة الأعصاب العلاجية في الأدمغة البشرية المصابة والمرضى.
على الرغم من أن الإصابات المخترقة لدماغ دروسوفيلا البالغ قد وصفت سابقا15,17,18، ركزت هذه الإصابات على الفصوص البصرية وليس الدماغ المركزي. وعلاوة على ذلك، لا توجد حتى الآن تعليمات مفصلة عن كيفية تنفيذ الإصابات. يصف هذا البروتوكول نموذجا لاختراق إصابة الدماغ المركزي Drosophila البالغ الذي يستنسخ أدلة ذات دلالة إحصائية لنشأة الأعصاب للبالغين بعد PTBI.
ويرجع استنساخ هذا البروتوكول PTBI، جزئيا، إلى الجسم الفطر كمنطقة الهدف الإصابة. جسم الفطر كبير ، ويتألف من ~ 2200 خلية عصبية مع التشعب المعقد و أربور المحور في صفائف كبيرة ونمطية للغاية18. تقع أجسام خلايا الخلايا العصبية لجسم الفطر بالقرب من سطح الدماغ ويمكن تصورها من خلال قطع الرأس باستخدام تعبير البروتين الفلوري الأخضر (GFP) (الشكل 1C). سلائف الجسم الفطر هي الخلايا الجذعية العصبية الماضي للخضوع ل موت الخلايا المبرمج خلال development13,12,19. وهكذا، العديد من الخلايا العصبية الجسم الفطر هي صغيرة جدا في وقت الانفجار. وأدى ذلك إلى فرضية أن جسم الفطر قد يكون أكثر إمكانات ميتوتيك من مناطق الدماغ الأخرى16. بالإضافة إلى ذلك ، فإن جسم الفطر أمر بالغ الأهمية للتعلم والذاكرة18. وهذا يسمح للمرء أن يسأل ما إذا كان تكوين الأعصاب PTBI الناجمة يؤدي إلى الانتعاش الوظيفي.
وتشمل العوامل الأخرى التي تسهم في إعادة إنتاج النتائج استخدام الذباب المتقاطع من الأنماط الجينية المتسقة، وأداء الصلبان في نفس الاتجاه في كل مرة، والتحكم بدقة في درجات الحرارة التنشئة والشيخوخة، وتحليل الذكور والإناث على حدة. استخدام الذباب F1 من خارج يقلل من احتمال تحليل العقول homozygous للطفرات العفوية. الصليب القياسي ل y[1] w[1]; UAS-mCD8-GFP;; OK107-GAL4 الإناث الكبار إلى y[1] ث [1] الذكور البالغين الذباب النتائج في ذرية F1 من النمط الجيني y[1] ث [1]; UAS-mCD8-GFP/+;; OK107-GAL4/+. يتم التعبير عن OK107-GAL4 في جميع الخلايا العصبية الجوهرية للجسم الفطر ويدفع التعبير عن مراسل غشاء ملزمة UAS-mCD8-GFP السماح التصور من أجسام الفطر وتوقعاتها. بالنسبة للمتصاليب perma-twin، يجب أن تظل الصلبان عند 17 درجة مئوية في جميع الأوقات للحفاظ على نظام تتبع النسب مغلقا. وهذا يضمن أنه لا توجد خلايا مقسمة وصفت أثناء التنمية وأن يتم تسمية الخلايا العصبية فقط الكبار المولد وغليا. وتحقيقا لهذه الغاية، يمكن أيضا الحفاظ على غرفة الطيران عند 17 درجة مئوية. على الرغم من أن الوصف الأولي للنظام perma-twin15 أوصى الذباب تربية في 18 درجة مئوية، وهذا يمكن أن يؤدي إلى وضع العلامات الخلفية كبيرة.
للاتساق، فمن المستحسن أيضا للحفاظ على السيطرة الذباب غير مصاب على لوحة ثاني أكسيد الكربون كما ينفذ واحد PTBI. وهذا يضمن أن كلا المجموعتين من الذباب لديها التعرض مخدر متطابقة. بالإضافة إلى ذلك ، من المستحسن أن تخترق القابلية للاستنساخ الرأس تماما. ومع ذلك ، يجب الحرص على عدم ثني طرف الدبوس ضد الوسادة ، مما يجعلها غير صالحة للاستخدام للإصابات المستقبلية. بالنسبة للممارسين المهرة ، لا يوجد ضرر غير مقصود يذكر لذباب PTBI. ومع ذلك ، فإن الضغط بشدة على الصدر لتثبيت الذبابة أثناء الإصابة يمكن أن يكون قاتلا. إحدى الطرق لتقييم مدى الإصابة غير المقصودة هي تحديد معدل وفيات ذباب PTBI بعد الإصابة ب 24 ساعة. بالنسبة للذباب المصاب من جانب واحد ، يمكن أن يكون هذا 50٪ أو أعلى للمبتدئين. لذلك ، لضمان أن النتائج الملاحظة ترجع إلى PTBI وليس إلى إصابة غير مقصودة ، ينصح بأن يمارس المبتدئون إدارة PTBI على ~ 20 يطير يوميا على مدى عدة أسابيع ولا يحللون الأدمغة الناتجة حتى يتم <10٪ باستمرار معدل الوفيات 24 ساعة.
لتحديد كمية الانتشار التي يحفزها PTBI الدماغ المركزي، يمكن استخدام كل من مكافحة الفوسفوهيستون H3 (PH3) مناعة و5-إيثينيل-2′-deoxyuridine (EdU) التأسيس. مكافحة PH3 تسميات الخلايا قبل وطوال مرحلة ما بعد الطور، والحد من الكشف عن سوى جزء صغير من الخلايا تقسيم بنشاط. وهكذا، تلطيخ المضادة PH3 يوفر لمحة جزئية فقط من الانتشار. EdU هو التناظرية الثيميدين التي يمكن دمجها في الحمض النووي توليفها حديثا. عن طريق تغذية الذباب EdU قبل وبعد الإصابة، فمن الممكن الحصول على صورة أكثر اكتمالا من الخلايا التي هي إما تقسيم أو قد انقسمت بعد الإصابة. حقيقة أن أي خلايا تنقسم يتم وضع علامة دائمة مفيدة على حد سواء لتحديد الخلايا ركوب الدراجات ببطء و المقايسة بقاء الخلايا بعد الانتشار الأولي. لأسباب غير واضحة، ولكن ربما بسبب نفاذية محدودة من حاجز الدم في الدماغ، ووضع العلامات EdU غير فعالة والتقارير الناقصة انتشار الخلايا في الدماغ الكبار. ويتضح ذلك من الأعداد المماثلة من خلايا PH3+ و EdU+ في كل من العقول التحكمية والتجريبية عند 24 ساعة بعد PTBI ومن خلال ملاحظة أن مجموعة فرعية فقط من الخلايا الجديدة في المستنسخين التوأمين بيرما تتضمن EdU16. لوضع العلامات القصوى ، من الضروري إطعام الذباب مسبقا باستخدام EdU لأن الذباب المصاب لا يستأنف التغذية لعدة ساعات بعد PTBI. تم تقييم التغذية عن طريق إضافة تلوين الطعام إلى محلول EdU ومراقبة كمية الصبغة في الأمعاء من خلال قطع البطن16.
وتجدر الإشارة إلى أنه في حين قدمنا بروتوكول تشريح الدماغ في الخطوة 4، يمكن استخدام تقنيات بديلة. العديد من هذه متوفرة في بروتوكولات المنشورة سابقا20,21,22. Drosophila melanogaster يقدم نموذجا منخفض التكلفة مع أدوات وراثية جزيئية قوية التي يمكن استخدامها لدراسة الآليات الكامنة وراء تجديد أنسجة متعددة، بما في ذلك القناة الهضمية ومكونات الجهاز العصبي. ويرد هنا نموذج جديد للإصابات قابل للاستنساخ يمكن استخدامه لدراسة الاستجابة لإصابة الدماغ. البيانات التي تم الحصول عليها باستخدام هذه البروتوكولات تدعم فكرة أن الدماغ المركزي Drosophila الكبار يحتفظ القدرة على الانتشار، وتوليد خلايا عصبية جديدة ردا على الإصابة. هذه الملاحظات تبرر إجراء مزيد من التحقيق في كل من مدى تكوين الأعصاب الكبار وآلياته الجزيئية الكامنة. بمجرد تحديد المكونات المشاركة في التجديد العصبي في هذا النظام ، يمكننا تحويل معرفتنا بالنشأة العصبية الدروزوفيليا البالغة إلى البشر.
The authors have nothing to disclose.
ونحن ممتنون لستايسي ريمكوس وبيكي كاتزنبرغر للمساعدة التقنية وإدواردو مورينو لتقاسم أسهم بيرما التوأم. ونود أن نشكر باري غانيتزكي وديفيد واسارمان على المناقشات الحيوية التي حسنت بلا شك العلم وكينت موك وكايلا غيرا وبيلي شبيجلبرغ على مساهماتهم في المختبر. تم تطوير الأجسام المضادة FasII من قبل كوري غودمان وتم الحصول عليها من بنك Hybridoma للدراسات التنموية ، الذي أنشأه NICHD في المعاهد القومية للصحة وحافظ عليه في جامعة أيوا ، قسم البيولوجيا ، مدينة أيوا ، IA 52242. تم الحصول على معظم سلالات دروسوفيلا المستخدمة في هذه الدراسة من مركز بلومينغتون دروسوفيلا للأسهم (BDSC; المعاهد القومية للصحة P40OD018537). وقد دعم هذا العمل المعهد الوطني للصحة T32 GM007133 (KLC)؛ المعاهد القومية للصحة NS090190 (GBF)؛ المعاهد القومية للصحة NS102698 (GBF)؛ كلية الدراسات العليا بجامعة ويسكونسن (GBF)؛ ومعهد القيادة النسائية في العلوم والهندسة (WISELI) (GBF).
#11 disposable scalpels | Santa Cruz Biotechnology | sc-395923 | used for separating Drosophila heads from trunks prior to brain dissection |
150 mm diameter black Sylgard dishes | Dow | 1696157 | made in the laboratory with reagents from Dow; used for brain dissection |
18 mm coverslips | any | for mounting brains on microscope slides | |
4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride (DAPI) | ThermoFisher | D1306 | for immunohistochemistry |
70% Ethanol | made from 95% ethanol sourced variously | ||
anti-mouse Cy5 | Jackson ImmunoResearch | 715-175-151 | for immunohistochemistry |
anti-rabbit 568 | ThermoFisher | A11036 | for immunohistochemistry |
bovine serum albumin (BSA) | SIgma Aldrich | A7030 | for immunohistochemisty |
Clear nail polish | any | for sealing coverslips | |
Click-It EdU labeling kit | InVitrogen | C10640 | to detect newly synthesized DNA |
CO2 bubbler | Genesee Scientific | 59-181 | for anesthesia |
CO2 pad | Genesee Scientific | 59-114 | for anesthesia |
CO2 regulator and supply | any | for anesthesia | |
Confocal microscope | any | for imaging fixed, stained and mounted brains | |
cotton plugs | Genesee Scientific | 51-101 | for EdU labeling |
Drosophila vials | Genesee Scientific | 32-109 | for EdU labeling |
Fix buffer (Pipes, EGTA, Magnesium; PEM) | components sourced from various companies | for fixing adult brains; 100 mM piperazine-N,N’-bis(2-ethanesulfonic acid) [PIPES], 1 mM EGTA, 1 mM MgSO4, pH 7.0 | |
Formaldehyde | Sigma Aldrich | 252549 | for fixing adult brains, added to PEM |
Grade 3 round Whatman filters, 23 mm round | Tisch Scientific | 1003-323 | for EdU labeling |
Microfuge tubes | any | for fixing and staining reactions and for storing Minutien pins | |
Microscope slides | any | for mounting brains | |
Minutien pins | Fine Science Tools | 26002-10 | for brain injury; 12.5 μm diameter tip and 100 μm diameter rod |
mouse anti-Fasiclin II | Developmental Studies Hybridoma Bank | 1D4-s | for immunohistochemistry |
NIGHTSEA stereo microscope fluorescence adaptor | Electron Microscopy Sciences | SFA-GR | fluorescence setup for dissecting microscope |
P20, P200 and P1000 pipettors and tips | any | for measuring solutions | |
phosphate buffered saliine (PBS) | components sourced from various companies | for dissecting brains and making immunohistochemistry blocking and washing solutions; 100 mM of K2HPO4, 140 mM of NaCl, pH 7.0 | |
phosphate buffered saline with 0.1% Triton X-100 (PT) | components sourced from various companies | for washing dissected brains | |
phosphate buffered saline with 0.1% Triton X-100 + 2% bovine serum albumin (PBT) | components sourced from various companies | blocking solution for immunohistochemistry and for diluting antibodies | |
rabbit anti-PH3 | Santa Cruz Biotechnology, Inc | sc-8656-R | for immunohistochemistry |
Reinforcement labels | Avery | 5721 | to maintain space between the microscope slide and the coverslip |
Size 0 paintbrushes | any | to manipulate and stabilize adult Drosophila during injury | |
Triton X-100 | Sigma Aldrich | 93443 | |
Two pair of #5 watchmakers forceps | Fine Science Tools | 11255-20 | used to hold the Minutien pins and for brain dissections |
Vectashield | Vector Laboratories | H-1000 | mounting medium for microscope slides |