כאן אנו מציגים פרוטוקול המתאר התמרה ויראלית של אזורי מוח בדידים עם מבנים אופטוגנטיים כדי לאפשר אפיון אלקטרופיזיולוגי ספציפי לסינפסה בפרוסות מוח של מכרסמים חריפים.
חקר התכונות הפיזיולוגיות של סינפסות מסוימות במוח, וכיצד הן עוברות שינויים פלסטיים, הוא אתגר מרכזי במדעי המוח המודרניים. טכניקות אלקטרופיזיולוגיות מסורתיות במבחנה משתמשות בגירוי חשמלי כדי לעורר תמסורת סינפטית. החיסרון העיקרי של שיטה זו הוא האופי הלא ספציפי שלה; כל האקסונים באזור האלקטרודה המגרה יופעלו, מה שמקשה על ייחוס אפקט לחיבור אפרנטי מסוים. ניתן להתגבר על בעיה זו על ידי החלפת גירוי חשמלי בגירוי מבוסס אופטוגנטיקה. אנו מתארים שיטה לשילוב אופטוגנטיקה עם הקלטות מהדקי טלאים במבחנה . זהו כלי רב עוצמה לחקר ההעברה הסינפטית הבסיסית והפלסטיות הסינפטית של קשרים סינפטיים מדויקים המוגדרים אנטומית, והוא ישים כמעט לכל מסלול במוח. כאן אנו מתארים את ההכנה והטיפול בווקטור נגיפי המקודד חלבון channelrhodopsin להזרקה כירורגית לאזור טרום-סינפטי בעל עניין (קליפת המוח הקדם-מצחית המדיאלית) במוח המכרסם ויצירת פרוסות חריפות של אזורי מטרה במורד הזרם (קליפת המוח האנטורינלית הלטרלית). כמו כן מוצג הליך מפורט לשילוב הקלטות מהדקי טלאים עם הפעלה סינפטית על ידי גירוי אור כדי לחקור פלסטיות סינפטית לטווח קצר וארוך. אנו דנים בדוגמאות לניסויים שמשיגים ספציפיות של מסלולים ותאים על ידי שילוב של אופטוגנטיקה ותיוג תאים תלויי Cre. לבסוף, אישור היסטולוגי של האזור הקדם-סינפטי של העניין מתואר יחד עם תיוג ביוציטין של התא הפוסט-סינפטי, כדי לאפשר זיהוי נוסף של המיקום המדויק וסוג התא.
הבנת הפיזיולוגיה של הסינפסות וכיצד הן עוברות שינויים פלסטיים היא בסיסית להבנת האופן שבו רשתות מוחיות מתפקדות במוח בריא1, וכיצד הן מתפקדות בהפרעות מוחיות. השימוש בפרוסות מוח חריפות של ex vivo מאפשר הקלטה של הפעילות החשמלית של סינפסות מנוירונים בודדים עם יחס אות לרעש גבוה באמצעות הקלטות של מהדק טלאי שלם. שליטה בפוטנציאל הממברנה ומניפולציה פרמקולוגית פשוטה מאפשרת בידוד של תת-סוגים של קולטנים. ניתן לבצע הקלטות אלה בספציפיות מעודנת כדי לזהות את הנוירון הפוסט-סינפטי, כולל מיקום למינרי ותת-אזורי2, מורפולוגיה תאית3, נוכחות של סמנים מולקולריים4, התחזיות האפקטיביות שלו5, או אפילו אם הוא היה פעיל לאחרונה6.
עם זאת, השגת ספציפיות של תשומות קדם-סינפטיות היא, עם זאת, קצת יותר מאתגרת. השיטה הקונבנציונלית השתמשה באלקטרודות גירוי כדי לעורר את האקסונים הפועלים בלמינה מסוימת. דוגמה לכך היא בהיפוקמפוס, שם גירוי מקומי בשכבה רדיאטום מפעיל סינפסות שמקרינות מ-CA3 לתת-השדה CA17. במקרה זה, הספציפיות הקדם-סינפטית מושגת כאשר קלט CA3 מייצג את הקלט המעורר היחיד הממוקם בתוך רדיאטום שכבה אשר מקרין לתאים פירמידליים CA18. רמה גבוהה זו של ספציפיות קלט הניתנת להשגה עם הפעלה קדם-סינפטית חשמלית קונבנציונלית של אקסונים CA3-CA1 היא, עם זאת, יוצא מן הכלל אשר בא לידי ביטוי במחקר אינטנסיבי כי סינפסה זו היה נתון. באזורים אחרים במוח, אקסונים ממסלולים רבים מתקיימים יחד באותה למינה, לדוגמה, בשכבה 1 של ניאוקורטקס9, ובכך הופכים גירוי קדם-סינפטי ספציפי לקלט לבלתי אפשרי עם אלקטרודות מגרה קונבנציונליות. זה בעייתי מכיוון שלקלטים סינפטיים שונים עשויות להיות תכונות פיזיולוגיות שונות; לכן, הגירוי המשותף שלהם עלול להוביל לאפיון שגוי של הפיזיולוגיה הסינפטית.
הופעתה של האופטוגנטיקה, הקידוד הגנטי של חלבוני ממברנה רגישים לאור (אופסינים) כגון channelrhodopsin-2 (ChR2), אפשרה הרחבה עצומה של אפשרויות לחקר תחזיות סינפטיות מבודדות בין אזורי מוח10,11. כאן אנו מתארים פתרון הניתן להכללה ובעלות נמוכה לחקר פיזיולוגיה סינפטית ארוכת טווח ופלסטיות. המבנים האופטוגנטיים מועברים באופן ספציפי מאוד באמצעות וקטורים נגיפיים המאפשרים שליטה מדויקת ביותר באזור העניין הקדם-סינפטי. הקרנות אפרנט יבטאו את הערוץ המופעל על ידי האור ויאפשרו הפעלה של סיבים אלה באזור מטרה. לפיכך, ניתן לחקור מסלולים ארוכי טווח, מפוזרים אנטומית, שלא ניתן להפעילם באופן עצמאי על ידי גירוי חשמלי מסורתי, לא ספציפי.
אנו מתארים, כמסלול לדוגמה, התמרה של קליפת המוח הקדם-מצחית המדיאלית (mPFC) עם וירוסים הקשורים לאדנו (AAVs) המקודדים אופסינים של תעלת קטיון מעוררת. לאחר מכן אנו מתארים את ההכנה של פרוסות חריפות מקליפת המוח האנטורינלית הלטרלית (LEC), הקלטות של מהדקי טלאי מנוירונים פירמידליים של LEC בשכבה 5, והפעלה מעוררת אור של תחזיות mPFC-LEC גלוטמטרגיות (איור 1). אנו מתארים גם את ההערכה ההיסטולוגית של אתר ההזרקה כדי לאשר את המיקום של האזור הקדם-סינפטי של עניין וזיהוי של מורפולוגיה של תאים פוסט-סינפטיים.
הפרוטוקול המוצג כאן מתאר שיטה לחקור הקרנות סינפטיות ארוכות טווח ספציפיות ביותר באמצעות שילוב של ניתוחים סטריאוטקסיים כדי לספק AAVs המקודדים מבנים אופטוגנטיים, ואלקטרופיזיולוגיה בפרוסות מוח חריפות (איור 1). יחד טכניקות אלה מציעות כלים לאפיון הפיזיולוגיה והפלסטיות של מעגלי?…
The authors have nothing to disclose.
עבודה זו נתמכת על ידי מענק Wellcome 206401/Z/17/Z. ברצוננו להודות לזפאר בשיר על חונכותו המקצועית ולד”ר קלייר בות’ על הסיוע הטכני וההערות על כתב היד.
0.2 mL tube | Fisher Scientific Ltd | 12134102 | |
10 µL pipette | Gilson | FD10001 | |
24 well plate | SARSTEDT | 83.3922 | |
3 way luer valve | Cole-Parmer | WZ-30600-02 | |
3,3′-Diaminobenzidine (DAB) substrate | Vector Laboratories | SK-4105 | |
40x objective | Olympus | LUMPLFLN40XW | |
4-aminopyridine | Hello Bio | HB1073 | |
4x objective | Olympus | PLN4X/0.1 | |
AAV9-CaMKiia-hChR2(E123T/T159C)-mCherry | Addgene | 35512 | Viral titre: 3.3×1013 GC/ml |
Achromatic lens | Edmund Optics | 49363 | Focusses visual spectrum and near-IR |
Benchtop microcentrifuge | Benchmark Scientific | C1005* | |
Biocytin | Sigma-Aldrich | B4261 | |
Borosillicate glass capillary | Warner Instruments | G150F-6 | |
Burr | Fine science tools | 19008-07 | |
CaCl2 | Sigma-Aldrich | C5670 | |
Camera – Qimaging Retiga Electro | Photometrics | 01-ELECTRO-M-14-C | |
Carbachol | Tocris | 2810 | |
Chlorhexidine surgical scrub | Vetasept | XHG008 | |
Clippers | Andis | 22445 | AGC Super 2-Speed Detachable Blade Clipper |
Collimation condenser lens | ThorLabs | ACL2520-A | |
Coverslips | Fisher Scientific Ltd | 10011913 | |
Cryostat | Leica | CM3050 S | |
CsMeSO4 | Sigma-Aldrich | C1426 | |
Cyanoacrylate glue | Rapid Electronics Ltd | 84-4557 | |
Data acquisition device | National Instruments | USB-6341 BNC | |
D-glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
Dichroic mirror 500 nm long-pass | Edmund Optics | 69899 | |
Dichroic mirror 600 nm long-pass | Edmund Optics | 69901 | |
Dichroic mirror cube | ThorLabs | CM1-DCH/M | |
EGTA | Millpore | 324626 | |
Electrode holder with side port | HEKA | 895150 | |
Emission filter | Chroma | 59022m | |
Excitation filter | Chroma | ET570/20x | |
Eye gel | Dechra | Lubrithal | |
Fine paint brush | Scientific Laboratory Supplies | BRU2052 | |
Guillotine | World Precision Instruments | DCAP | |
HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
Hydrogen peroxide solution | Sigma-Aldrich | H1009 | 30% (w/w) |
Isoflurane | Henry Schein | 988-3245 | |
Isopentane | Sigma-Aldrich | M32631 | |
KCl | Sigma-Aldrich | P3911 | |
k-gluconate | Sigma-Aldrich | G4500 | |
Kinematic fluorescence filter cube | ThorLabs | DFM1T1 | |
LED driver | ThorLabs | LEDD1B | |
Lidocaine ointment | Teva | 80007150 | |
MgATP | Sigma-Aldrich | A9187 | |
MgCl | Sigma-Aldrich | M2670 | |
MgSO4 | Sigma-Aldrich | M7506 | |
Micro drill | Harvard Apparatus | 75-1887 | |
Microelectrode puller | Sutter instruments | P-87 | |
Microinjection syringe | Hamilton | 7634-01/00 | |
Microinjection syringe needle | Hamilton | 7803-05 | Custom specification: gauge 33, length 15mm, point style 4 – 12° |
Microinjection syringe pump | World Precision Instruments | UMP3T-1 | |
Mounted blue LED | ThorLabs | M470L5 | |
Mounted green LED | ThorLabs | M565L3 | |
Na2HPO4.7H2O | Sigma-Aldrich | S9390 | |
NaCl | Sigma-Aldrich | S9888 | |
NaGTP | Sigma-Aldrich | G8877 | |
NaH2PO4 | Sigma-Aldrich | S0751 | |
NaH2PO4.H2O | Sigma-Aldrich | S9638 | |
NaHCO3 | Sigma-Aldrich | S5761 | |
NIR LED | OSRAM | SFH4550 | Used for refracted IR imaging of slice, differential interference contrast (DIC) optics is another commonly used method |
OCT medium | VWR International | RAYLLAMB/OCT | Optimal cutting temperature medium |
Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | |
Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
Patch clamp amplifier | Molecular Devices | 700A | |
Peristaltic pump | World Precision Instruments | Ministar | |
Poly-L-lysine coated microscope slides | Fisher Scientific Ltd | 23-769-310 | |
Recording chamber | Warner Instruments | RC-26G | |
Scalpel blade | Swann Morton | #24 | |
Slice anchor | Warner Instruments | SHD-26-GH/15 | |
Stereotaxic frame | Kopf | Model 902 | |
Stereotaxic holder for micro drill | Harvard Apparatus | 75-1874 | |
Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | |
Surgical Microscope | Carl Zeiss | OPMI 1 FR pro | |
Suture | Ethicon | W577H | |
Syringe filter for intracellular recording solution | Thermo Scientific Nalgene | 171-0020 | |
Tetrodotoxin citrate | Hello Bio | HB1035 | |
Transfer pipettes | Fisher Scientific Ltd | 10458842 | |
Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | |
Upright fluorescence microscope | Leica | DM6 B | |
VECTASHIELD Antifade Mounting Medium with DAPI | Vector Laboratories | H-1200-10 | |
VECTASTAIN ABC-HRP kit | Vector Laboratories | PK-4000 | |
Vibratome | Campden Instruments | 7000smz-2 | |
WinLTP | https://www.winltp.com/ | Version 2.32 | Data acquisition software |
Solution | |||
aCSF | |||
sucrose cutting solution | |||
PFA | |||
Intracellular? |