생체발광-루시퍼라제 효소에 의해 방출되는 광은 소분자 기질인 루시페린-광감각 단백질을 활성화시키기 위해 이용될 수 있고, 이로써 광 자극에 또 다른 차원을 추가하고 시간적 및 공간적 스케일에 걸쳐 세포에서 다수의 광-매개 기능의 조작을 가능하게 한다.
생체 발광 – 소분자 기질 인 루시페린을 산화시키는 루시퍼라제 효소에 의해 방출되는 빛은 뉴런에서 광 게이트 이온 채널 및 펌프를 활성화시키기 위해 시험관내 및 생체 내에서 사용되어 왔습니다. 이 생체 발광 광유전학 (BL-OG) 접근법은 광유전학 도구에 화학 유전 적 구성 요소를 부여하지만, 신경 과학에서 사용하는 것으로 제한되지는 않습니다. 오히려, 생체 발광은 임의의 광감각 단백질을 활성화시키기 위해 이용될 수 있고, 따라서 세포에서 다수의 광-매개 기능의 조작을 가능하게 한다. 다양한 루시페라아제-루시페린 쌍은 서로 다른 파장의 빛과 빛의 세기를 필요로 하는 광감각 단백질과 일치할 수 있다.
특정 용도에 따라, 효율적인 광 전달은 루시페라제-광수용체 융합 단백질을 사용하거나 간단한 공동-형질감염에 의해 달성될 수 있다. 광-의존성 이량체화 또는 형태적 변화에 기초한 광감각 단백질은 단백질 국소화, 전사에 이르는 세포내 신호전달 경로의 조절로부터 세포 과정에 영향을 미치기 위해 생체발광에 의해 구동될 수 있다. 아래의 프로토콜은 세포 및 유기체에서 생체 발광 활성화의 실험 실행을 자세히 설명하고 생체 발광 구동 재조합효소 및 전사 인자를 사용한 결과를 설명합니다. 이 프로토콜은 시험 관 내 및 생체 내에서 생체 발광 광유전학을 수행하기위한 기본 절차를 조사관 에게 제공합니다. 설명된 접근법들은 다수의 상이한 실험적 패러다임들로 더욱 확장되고 개별화될 수 있다.
광감각 단백질은 물리적 광원 또는 그의 기질인 루시페린의 존재하에 루시퍼라제 효소로부터의 빛에 의해 활성화되어 생체발광을 생성할 수 있다. 밀리 또는 펨토초 시간 척도 및/또는 단일 셀 공간 분해능이 필요한 응용 제품의 경우 물리적 광원(레이저 및 발광 다이오드(LED))만이 이러한 스케일에 맞게 조정할 수 있는 유일한 광원입니다. 예를 들어 밀리 초 시간적 조절1을 가진 초파리 유충을 개발할 때 반대 극을 자극하는 데 사용되는 빛의 공간적 제한1 또는 미토콘드리아 세뇨관과 같은 단일 세포 구조의 정확한 자극2. 그러나 광 스위치에 대한 다른 많은 응용 분야는 확장된 공간 제어와 비침습적으로 그리고 빛 손상 없이 반복되는 적용을 포함하지만 미세한 시간 척도와 조정 가능한 강도로 정의된 시간 제어를 포함하여 우선 순위가 다릅니다. 여기서, 광감지 도메인을 활성화시키기 위해 대체 광원으로서 루시페라아제를 사용하는 것은 몇 가지 장점이 있다. 광섬유 광 활성화와는 달리, 생체 발광은 광원이 유전적으로 인코딩됨에 따라 표적 세포 집단에서 발현되는 모든 광 감지 도메인에 도달한다. 생체 발광을 사용하면 광섬유에 의한 조직 및 세포 손상에 대한 우려를 완화하고 물리적 광 노출을 확대합니다. 빛은 루시퍼라제 기질의 적용으로 켜집니다. 발병은 투여 경로에 따라 즉시 시험관내 및 생체내에서 지속되며 ∼15-30분 동안 지속된다; 빛의 연장된 존재 또는 phasic 자극은 상이한 루시페린과 기질의 추가적인 또는 반복적인 적용으로 달성될 수 있다3. 마지막으로, 생체 발광은 루시페린의 농도를 변화시킴으로써 조정될 수 있다.
이온-이동 광수용체, 즉 채널로돕신 또는 펌프와 같은 광유전학적 요소를 활성화시키기 위한 생체발광의 사용은 광범위하게 입증되었다4,5,6,7,8. 이러한 BioLuminescent OptoGenetics (BL-OG) 접근법은 마우스 및 래트5,6,7,9,10,11,12 에서 생체내 실험에 이용되었다. 옵신의 BL-OG 활성화는 적어도 ~33 μW/mm2의 생체 발광의 양을 필요로 하는 것으로 밝혀졌으며, 더 높은 발광으로 활성화 효율이 증가[6,9]. 이온-이동 감각 광수용체는 이온이 움직이지 않는 자연에서 발견되는 감각 광수용체의 큰 우발적 인 하위군이다13,14. 식물이나 박테리아의 광감지 도메인과 같은 비 이온 이동 광수용체를 활성화하는 생체 발광의 확장은 비 이온 이동 광 센서가 채널로돕신보다 훨씬 더 빛에 민감하여 이온 이동 광유전학 요소로 이미 얻은 것보다 생체 발광을 가진 광 센서의 더 나은 구동을 보장한다는 보고서15,16에 의해 권장됩니다. 최근에, 몇몇 간행물은 광-산소-전압-감지 (LOV) 도메인, 청색-광-플라빈 (BLUF) 도메인, 및 크립토크롬 (CRYs)3,17,18,19,20,21,22를 포함하는 다양한 광수용체의 활성화를 위한 광원으로서 생체발광의 사용을 보고하였다 (표 1 ). 반응성 산소 종-유도 세포 사멸, cAMP 합성, 단백질 모집 및 해리에서 게놈 재조합 및 전사 유도에 이르기까지 세포 내 과정을 표적으로 하는 광 스위치의 생체발광 구동 활성화를 위한 응용 분야.
이 프로토콜은 생체 발광 기반 광유전학 도구의 일반적인 설계를 간략하게 설명하고 세포 및 유기체에서 생체 발광 활성화의 실험 실행을위한 절차를 자세히 설명합니다. 여기에는 방, 조직 배양 후드 및 인큐베이터를 설치하는 방법에 대한 설명과 생체 발광 작업을위한 현미경뿐만 아니라 루시페린을 준비하는 단계부터 적용까지의 단계가 포함됩니다. 이 프로토콜은 시험 관내 및 생체내에서 BioLuminescent OptoGenetics (BL-OG)를 수행하기 위한 기본 절차를 조사관에게 제공합니다. 기술된 접근법들은 상이한 실험 패러다임들로 더욱 확장되고 개별화될 수 있다. 우리는이 프로토콜이 광유전학 생물학적 연구에서 생체 발광의 사용을 채택하는 것을 촉진 할 것으로 기대합니다.
청색에서 적색광까지 광감각 단백질의 활성화 스펙트럼과 일치하는 발광 파장을 가진 다양한 루시페라아제와 루시페린이 있습니다14,29. 방출 및 여기 파장을 정렬하는 것 외에도 페어링이 가장 잘 작동하는 선험적 인 방법을 결정할 수있는 신뢰할 수있는 방법이 없습니다. 따라서, 루시페린-루시퍼라제 쌍이 광감각 시스템을 구동하는 세포와 유기체에서 어떻게 작용하는지를 실험적으로 결정할 필요가 있다.
이 프리젠 테이션에 설명 된 프로토콜은 루시페린을 준비하는 방법과 생체 외 및 생체 내에서 루시페린을 적용하는 방법과 생체 발광을 활용한 실험을위한 방, 조직 배양 후드, 인큐베이터 및 현미경 설정에 대한 지침을 설명합니다. 대표적인 실험에서는 여러 광감각 단백질 (CRY/CIB, EL222, VVD, LOV)을 가진 다른 루시페라아제 (NanoLuc, Gaussia luciferase)가 사용되어 생체 발광 대 물리적 빛, 공동 형질감염 대 융합 단백질, 신호 대 잡음 비교 및 다른 판독 분석의 효과를 입증했습니다. 광감각 단백질을 활성화시키는 생체발광의 더 많은 응용은 전사 이외에 세포 사멸, cAMP 합성 및 단백질 이동의 유도를 표적화하는 몇몇 그룹으로부터의 간행물에 기술되어 있다(표 1).
단순히 발광 및 광 감지 부품을 공동 트랜스펙션하는 것이 좋은 시작입니다. 변수는 이미터와 센서의 몰비입니다. 알려지지 않은 것은 어둠 속에서의 센서 활동의 배경 수준, 빛의 강도 및 지속 시간과 관련된 센서 활동, 물리적 및 생물학적 빛을 비교하는 센서 활성화의 효율성입니다. 융합 구조는 이미터와 센서의 몰비를 1:1로 유지하고 광 이미터를 광 감지 도메인에 가깝게 하는 장점이 있지만, 광감각 액추에이터의 성능에 영향을 주지 않으면서 테더링할 위치(N- 또는 C-터미너스) 및 링크하는 방법(링커 길이 및 구성)과 같은 다른 고려 사항이 작용합니다.
시험관내 및 생체내 실험의 경우, 루시페린의 농도를 변화시키거나 루시페린이 각각의 센서에 이용가능하게 되는 시간을 변화시킴으로써 생체발광 발광을 튜닝하기 위한 다수의 옵션이 있다. 최소량 및 시간은 광 활성화와 함께 예상되는 효과의 존재 또는 부재에 의해 결정된다. 대조적으로, 각각의 최대치는 주로 장기간에 걸쳐 루시페린의 고농도에 대한 세포의 내성에 의해 결정됩니다. 상기 예에서 선택된 CTZ의 농도인 100 μM은 HEK293 세포에서 뉴런에 이르기까지 다양한 세포 유형에 대한 상한선에 가깝습니다. 목표는 표적 광감지 도메인의 활성화를 달성하기 위해 가능한 한 짧은 시간 동안 가능한 한 낮은 농도를 사용하는 것이다. 이것은 높은 발광을 가진 루시페라아제와 높은 광 감도를 가진 광수용체를 사용하여 더 쉽게 달성 될 것입니다.
광수용체를 구동하기 위한 생체발광은 설치류(마우스, 래트)에서 광감지 단백질이 발현될 뿐만 아니라 광수용체 발현 세포를 통해 피하 또는 복강내로 이식되어 왔다. 원칙적으로 인간이 아닌 영장류에서 물고기 또는 파리에 이르기까지 다른 종에 접근하는 것을 막는 데는 한계가 없습니다. 루시페린에 대한 유기체의 투과성에 따라, 적용은 루시페린을 주변 물(예를 들어, 물고기 유충(30))에 적용하는 것만큼 쉬울 수 있다. 새로운 유기체에서 BL-OG를 사용하기 전에 루시페린이 선택한 응용 경로를 통해 목표에 도달하는지 확인하기 위해 파일럿 실험을 수행해야합니다.
실험 설계의 중요한 측면은 결과 해석에 중요한 다양한 컨트롤입니다. 광감각 단백질에 작용하는 루시퍼라아제에 의해 구동되는 리포터를 발현하는 세포는 루시퍼라아제가 결여되거나 광감각 단백질이 결여된 세포와 비교되어야 한다. 또한, 루시페린에 노출된 세포, 비히클 또는 어둠 속에 보관된 세포들 사이에서 비교가 이루어져야 한다. 생체 발광 구동 광수용체 활성화의 효과를 평가하기 위한 다양한 분석의 한계를 깨닫는 것도 중요하다. 예를 들어, 생체발광 활성화 전사의 효능은 리포터 유전자가 직교 루시퍼라아제(luminometer, IVIS) 또는 형광 단백질(형광-활성화 세포 분류, 현미경 이미지 분석)인지 여부에 따라 상이한 방식으로 시험될 수 있다. 기본 효과는 테스트 플랫폼 간에 재현 가능해야 하지만 효과의 양적 측면은 상당히 다를 수 있습니다.
광수용체의 생체발광 활성화는 제한된 수의 루시페라아제 및 광감각 단백질에 대해 지금까지 시험 관 내 및 생체내 둘 다에 대해 입증되었다. 그것은 더 많은 생물학적 과정을 활성화시키기 위해 광수용체의 큰 부류로 확장될 수 있다. 접근법의 이러한 확장은 자연 발생 루시페라제보다 훨씬 높은 발광과 다른 용도로 조정 가능한 운동 적 특징을 가진 새로운 루시페라제 및 루시페라아제 – 형광 단백질 쌍의 지속적인 개발에 의해 더욱 촉진됩니다. 이러한 발전은 새로운 루시페린의 생성과 평행을 이루며 밝기와 색상 팔레트를 더욱 증가시킵니다29. 이 도구 플랫폼은 살아있는 세포, 조직 및 유기체 내부의 세포 내 역학 및 세포 상호 작용을 조작하고 조사하는 응용 프로그램을 제공합니다.
The authors have nothing to disclose.
우리는 Ca-FLARE 프로테아제, 전사 인자 및 리포터 (Addgene # 92214, 92213, 92202), TM-CIBN-BLITz1-TetR-VP16 및 NES-CRY2PHR-TevC (Addgene # 89878, 89877), CRY-GalΔDD (B1013) 및 CIB-VP64 (B1016) (Addgene # 92035, 92037)에 대한 C. Tucker (Addgene # 92035, 92037), pGL2-GAL4-UAS-Luc (Addgene #33020)의 경우 M. Walsh (Addgene #33020), VP-EL222 및 C120-Fluc의 K. Gardner, iCreV를 출판 전에 사용할 수있게 해준 A. Cetin 및 H. Zeng에 대한 동료들에게 감사드립니다. 이 연구는 NSF (NeuroNex 1707352), NIH (U01NS099709), W.M. Keck Foundation 및 스웨덴 연구위원회 A.B. (2016-06760)의 보조금으로 지원되었습니다.
ABI 25W Deep Red 660 nm LED Light Bulb | Amazon | to be used with any lamp stand | |
Black Microcentrifuge Tubes, 0.5 mL, Argos Technologies | Fisher Scientific | 03-391-166 | |
Black Microcentrifuge Tubes, 1.5 mL, Argos Technologies | Fisher Scientific | 03-391-161 | |
Black Nylon, Polyurethane-Coated Fabric (1.5 m x 2.7 m) x 0.12 mm (thick) | THOR LABS | BK-5 | |
C120-Fluc | K. Gardner | ||
CaCl2 | Sigma | C8106; CAS: 10035-04-8 | |
Ca-FLARE protease, transcription factor and reporter | Addgene # 92214, 92213, 92202 | A. Ting | |
CIB-VP64 (B1016) | Addgene # 92037 | C. Tucker | |
CRY-GalΔDD (B1013) | Addgene # 92035 | C. Tucker | |
CTZ | Prolume Inc. (NanoLight) | 303 | formulation for in vitro applications with Gaussia luciferases |
CTZ (Water soluble native coelenterazine) | Prolume Inc. (NanoLight) | 3031 | formulation for in vivo applications with Gaussia luciferases |
D-(+)-Glucose | Sigma | G8270; CAS: 50-99-7 | |
D-Luciferin, Potassium Salt | Gold Biotechnology | LUCK | |
DMEM | Thermo Fisher | 11960044 | |
D-PBS, no calcium, no magnesium | Thermo Fisher | 14190144 | |
hCTZ | Prolume Inc. (NanoLight) | 301 | formulation for in vitro applications with Oplophorus luciferases |
HEK293 | ATCC | CRL-1573 | |
HeLa | ATCC | CCL-2 | |
HEPES | Sigma | H3375; CAS: 7365-45-9 | |
iCreV | A. Cetin and H. Zeng | ||
In Vivo Imaging System (IVIS) | Perkin-Elmer | Lumina LT | |
KCl | Sigma | P5405; CAS: 7447-40-7 | |
LED Array Driver | Amuza | LAD-1 | |
LED Array for Multiwell Plates | Amuza | LEDA-x | |
Lipofectamine 2000 Reagent | Invitrogen | 11668-019 | Transfection reagent |
Luminometer | Molecular Devices | SpectraMax L | |
MgCl2 Hexahydrate | Sigma | M2670; CAS: 7791-18-6 | |
NaCl | Sigma | S7653; CAS: 7647-14-5 | |
NanoFuel Solvent | Prolume Inc. (NanoLight) | 399 | for dissolving CTZ preparations for in vitro use |
NaOH | Sigma | 221465; CAS: 1310-73-2 | |
NES-CRY2PHR-TevC | Addgene # 89877 | H. Kwon | |
Opti-MEM | Thermo Fisher | 11058021 | transfection medium |
PDL coated coverslips (12 mm, 15 mm, 18 mm) | Neuvitro Corporation | GG-12-PDL, GG-15-PDL , GG-18-PDL | |
pGL2-GAL4-UAS-Luc | Addgene #33020 | M. Walsh | |
Prizmatix USB Pulser TTL Generator for Optogenetics | Goldstone Scientific | ||
TM-CIBN-BLITz1-TetR-VP16 | Addgene # 89878 | H. Kwon | |
TrypLE Express | Gibco | 12604-013 | |
Vehicle (Water-soluble carrier without CTZ) | Prolume Inc. (NanoLight) | 3031C | control for in vivo applications with CTZ |
VP-EL222 | K. Gardner |