وقد تم تقديم بروتوكول لتصوير microtubules الحيوية في الجسم الحي باستخدام البروتين ملزمة نهاية المسمى fluorescently. وصفنا أساليب لتسمية, صورة, وتحليل microtubules الحيوية في الخلايا العصبية الميكروتبول الجانبي الخلفي (PLM) من C. elegans.
في الخلايا العصبية، كان التوجه microtubule مقيم رئيسي لتحديد المحاور التي لديها زائد نهاية من microtubules و dendrites التي لديها عموما اتجاه مختلط. هنا نحن وصف أساليب لتسمية, صورة, وتحليل ديناميات microtubule والنمو أثناء تطوير وتجديد الخلايا العصبية التي تعمل باللمس في C. elegans. باستخدام المراسلين الفلورسنت المشفرة وراثيا من نصائح microtubule، ونحن صورت microtubules أكسنال. يمكن قياس التغيرات المحلية في سلوك microtubule الذي يبدأ تجديد المحور بعد استئصال الاكستوم باستخدام هذا البروتوكول. هذا المقايسة قابلة للتكيف مع الخلايا العصبية والخلفيات الوراثية الأخرى للتحقيق في تنظيم ديناميات microtubule في مختلف العمليات الخلوية.
الخلايا العصبية لديها بنية متقنة مع مقصورات متخصصة مثل التشعبات، والهيئات الخلية، محاور عصبية، ونقاط الاشتباك العصبي. هيكل الخلايا العصبية الخلوية تتكون من microtubules، microfilaments، و neurofilaments وتنظيمها متميزة تدعم مقصورات الخلايا العصبية هيكليا ووظيفيا1،2،3،4،5،6،7،8،9،10 . على مر السنين، تم تحديد منظمة microtubule كمحدد رئيسي للقطب العصبية وظيفة. كما الخلايا العصبية الخضوع لإعادة عرض الهيكلية أثناء التنمية أو التجديد, ديناميات microtubule والتوجه تحديد الهوية, استقطاب النقل, نمو, وتطوير مختلف مقصورات الخلايا العصبية7. ولذلك، فمن الضروري لتقييم ديناميات microtubule والتوجه في الجسم الحي لربط مع عملية إعادة عرض الخلايا العصبية.
وتتكون microtubules من protofilaments من α β توبولين heterodimers مع نهايات زائد ديناميكية ومستقرة نسبيا ناقص ينتهي11،12. وقد مكن اكتشاف مجمع تلميح زائد والبروتينات المرتبطة ملزمة نهاية منصة لتقييم منظمة microtubule13. نهاية ملزمة البروتينات (EBP) ترتبط عابر مع نهايات زائد المتزايد من microtubule وديناميات ارتباطها لنمو protofilaments microtubule14،15. بسبب الارتباط المتكرر والتفكك من مجمع تلميح زائد مع microtubule، وظيفة انتشار نقطة من EBP GFP الموسومة يظهر على أنه “المذنب” في فيلم الفاصل الزمني15،16. منذ الملاحظة الرائدة في الخلايا العصبية الثديية16، تم استخدام بروتينات الربط النهائي الموسومة بالبروتينات الفلورية لتحديد ديناميات microtubule عبر أنظمة نموذجية مختلفة وأنواع الخلايا العصبية17و18و19و20و21و22و23.
نظرا لنظامه العصبي البسيط وجسمه الشفاف ، أثبت C. elegans أنه نظام نموذجي ممتاز لدراسة إعادة عرض الخلايا العصبية أثناء التطوير والتجديد في الجسم الحي. هنا نحن وصف أساليب لتسمية, صورة, وتحليل ديناميات microtubule والنمو أثناء تطوير وتجديد الخلايا العصبية التي تعمل باللمس في C. elegans. باستخدام ترميز وراثيا EBP-2::GFP, صورنا microtubules في الخلايا العصبية PLM, مما سمح لنا لتحديد قطبية microtubules في اثنين من neurites مختلفة من هذه الخلايا العصبية24. تسمح هذه الطريقة بمراقبة المذنبات EBP وتحديد كميتها كمقياس لديناميكيات microtubule في سياقات خلوية مختلفة ، على سبيل المثال ، يمكن تقييم التغيرات المحلية في سلوك microtubule الذي يبدأ تجديد المحور بعد استئصال الاكستوم باستخدام بروتوكولنا. يمكن تكييف هذا المقايسة للتحقيق في تنظيم ديناميات microtubule في مختلف العمليات الخلوية في أنواع الخلايا المتنوعة والخلفيات الوراثية.
كان فهم ديناميكيات الميكروتبول محور تركيز رئيسي في مجال أبحاث الهيكل الخلوي على مر السنين. Microtubules الخضوع للنوى وكارثة جنبا إلى جنب مع عملية مستمرة من عدم الاستقرار الديناميكي44،45،46،47. وقد تم الحصول على ?…
The authors have nothing to disclose.
نشكر يشي جين وأندرو تشيشولم على الدعم الأولي والإجهاد المستخدم في الدراسة. تم الاستفادة من سلالة البكتيريا OP50 تجاريا من مركز علم الوراثة Caenorhabditis (CGC) بتمويل من مكتب المعاهد القومية للصحة لبرامج البنية التحتية للبحوث (P40 OD010440). كما نشكر دارميندرا بوري على توحيد الإجراءات التجريبية. يتم تمويل الدراسة من المنحة الأساسية للمركز الوطني لأبحاث الدماغ (بدعم من إدارة التكنولوجيا الحيوية، الحكومة الهندية)، DBT/Wellcome Trust India Alliance في وقت مبكر منحة مهنية (منحة # IA/E/18/1/504331) إلى S.D.، ويلكوم ترست-DBT الهند التحالف منحة وسيطة (منحة # IA/I/13/1/500874) إلى A.G.-R ومنحة من مجلس البحوث العلمية والهندسية (الصربية: CRG/2019/002194) إلى A.G.R.
CZ18975 worm strain | Yishi Jin lab | CZ18975 | Generated by Anindya Ghosh-Roy |
Agarose | Sigma | A9539 | Mounting worms |
Coverslip (18 mm x 18 mm) | Zeiss | 474030-9010-000 | Mounting worms |
Dry bath with heating block | Neolab | Mounting worms | |
Glass slides (35 mm x 25 mm) | Blue Star | Mounting worms | |
Polystyrene bead solution (4.55 x 10^13 particles/ml in aqueous medium with minimal surfactant) | Polysciences Inc. | 00876 | Mounting worms |
Test tubes | Mounting worms | ||
OP50 bacterial strain | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | OP50 | Worm handling |
60mm petri plates | Praveen Scientific | 20440 | Worm handling |
Aspirator/Capillary | VWR | 53432-921 | Worm handling |
Incubator | Panasonic | MIR554E | Worm handling |
Platinum wire | Worm handling | ||
Stereomicroscope with fluorescence attachment | Leica | M165FC | Worm handling |
0.3% Sodium Chloride | Sigma | 71376 | Nematode Growth Medium |
0.25% Peptone | T M Media | 1506 | Nematode Growth Medium |
10mg/mL Cholesterol | Sigma | C8667 | Nematode Growth Medium |
1mM Calcium chloride dihydrate | Sigma | 223506 | Nematode Growth Medium |
1mM Magnesium sulphate heptahydrate | Sigma | M2773 | Nematode Growth Medium |
2% Agar | T M Media | 1202 | Nematode Growth Medium |
25mM Monobasic Potassium dihydrogen phosphate | Sigma | P9791 | Nematode Growth Medium |
0.1M Monobasic Potassium dihydrogen phosphate | Sigma | P9791 | 1X M9 buffer |
0.04M Sodium chloride | Sigma | 71376 | 1X M9 buffer |
0.1M Ammonium chloride | Fisher Scientific | 21405 | 1X M9 buffer |
0.2M Dibasic Disodium hydrogen phosphate heptahydrate | Sigma | S9390 | 1X M9 buffer |
Glass bottles | Borosil | Buffer storage | |
488 nm laser | Zeiss | Imaging | |
5X objective | Zeiss | Imaging | |
63X objective | Zeiss | Imaging | |
Camera | Photometrics | Evolve 512 Delta | Imaging |
Computer system for Spinning Disk unit | HP | Intel ® Xeon CPU E5-2623 3.00GHz | Imaging |
Epifluorescence microscope | Zeiss | Observer.Z1 | Imaging |
Halogen lamp | Zeiss | Imaging | |
Mercury Arc Lamp | Zeiss | Imaging | |
Spinning Disk Unit | Yokogawa | CSU-X1 | Imaging |
ZEN2 software | Zeiss | Imaging | |
Image J (Fiji Version) | Image analysis and processing | ||
Adobe Creative Cloud | Adobe | Image analysis and processing | |
Computer system for Image Analysis | Dell | Intel ® Core ™ i7-9700 CPU 3.00GHz | Image processing/Representation |