פרוטוקול להדמיית המיקרוטובולות הדינמיות ב-vivo באמצעות חלבון מחייב קצה עם תווית פלואורסצנטית הוצג. תיארנו את השיטות לתיוג, תמונה וניתוח המיקרוטובולות הדינמיות בתאי העצב של מיקרוטובול לרוחב אחורי (PLM) של C. elegans.
בתאי עצב, אוריינטציה microtubule היה מעריך מפתח לזהות אקסונים שיש להם פלוס סוף החוצה microtubules ו דנדריטים כי בדרך כלל יש אוריינטציה מעורבת. כאן אנו מתארים שיטות לתיוג, תמונה וניתוח הדינמיקה והצמיחה של המיקרוטובלים במהלך הפיתוח וההתחדשות של נוירוני מגע ב- C. elegans. באמצעות כתבים פלואורסצנטיים מקודדים גנטית של טיפים מיקרוטובולים, צילמנו את microtubules האקסוני. ניתן לכמת את השינויים המקומיים בהתנהגות המיקרוטובול היוזם התחדשות אקסון בעקבות אקסוטומיה באמצעות פרוטוקול זה. בדיקה זו ניתנת להתאמה לנוירונים אחרים ורקעים גנטיים כדי לחקור את הרגולציה של דינמיקת microtubule בתהליכים תאיים שונים.
לנוירונים יש ארכיטקטורה משוכללת עם תאים מיוחדים כמו דנדריטים, גופי תאים, אקסונים וסינפסות. הציטוסקלטון העצבי מורכב מהמיקרוטובולות, המיקרופילמנטים והנוירופילמנטים והארגון הייחודי שלהם תומך בתאים העצביים מבחינה מבנית ותפקודית1,2,3,4,5,6,7,8,9,10 . במהלך השנים, ארגון microtubule זוהה כגורם מכריע של קוטביות עצבית ותפקוד. כאשר נוירונים עוברים שיפוץ מבני במהלך הפיתוח או ההתחדשות, הדינמיקה והכיוון של microtubule קובעים את הזהות, התחבורה המקוטבת, הצמיחה והפיתוח של תאים עצביים שונים7. לכן, חובה להעריך את הדינמיקה והכיוון של המיקרו-קוטביות ב-vivo כדי לתאם עם תהליך השיפוץ העצבי.
Microtubules מורכב פרוטופילמנטים של הטרודימרים α β טובולין עם קצוות פלוס דינמיים ומינוס יציב יחסית מסתיים11,12. גילוי קומפלקס הקצה פלוס וחלבונים מחייבים הקשורים לקצה אפשרו פלטפורמה להעריך את ארגון microtubule13. חלבונים מחייבים בסופו של דבר (EBP) מקשרים באופן ארעי עם הקצוות הגדלים פלוס של microtubule ואת הדינמיקה עמותה מתואמים לצמיחה של protofilaments microtubule14,15. בשל שיוך תכופים וניתוק של קומפלקס קצה פלוס עם microtubule, פונקציית התפשטות הנקודה של GFP מתויג EBP מופיע כמו “כוכב שביט” בסרט timelapse15,16. מאז התצפית החלוצית בתאי העצב של היונקים16, חלבונים מחייבים בסופו של דבר מתויגים עם חלבונים פלואורסצנטיים שימשו לקביעת דינמיקת microtubule על פני מערכות מודל שונות וסוגי נוירונים17,18,19,20,21,22,23.
בשל מערכת העצבים הפשוטה שלה הגוף השקוף, C. elegans הוכיח להיות מערכת מודל מעולה ללמוד שיפוץ עצבי במהלך פיתוח והתחדשות ב vivo. כאן אנו מתארים שיטות לתיוג, תמונה וניתוח הדינמיקה והצמיחה של המיקרוטובלים במהלך הפיתוח וההתחדשות של נוירוני מגע ב- C. elegans. באמצעות EBP-2::GFP מקודד גנטית, צילמנו את המיקרוטובולות בנוירון PLM, מה שאיפשר לנו לקבוע את הקוטביות של המיקרוטובולות בשני נוריטים שונים של הנוירון הזה24. שיטה זו מאפשרת התבוננות וכימות של שביט EBP כמדד לדינמיקת מיקרוטובול בהקשרים תאיים שונים, לדוגמה, ניתן להעריך את השינויים המקומיים בהתנהגות המיקרוטובלים היוזמת התחדשות אקסון בעקבות אקסוטומיה באמצעות הפרוטוקול שלנו. בדיקה זו יכולה להיות מותאמת כדי לחקור את הרגולציה של דינמיקת microtubule בתהליכים תאיים שונים בסוגי תאים מגוונים ורקעים גנטיים.
הבנת הדינמיקה של המיקרוטובלים הייתה מוקד מרכזי בתחום חקר הציטוסד לאורך השנים. Microtubules לעבור התגרענות וקטסטרופה יחד עם תהליך מתמשך של חוסר יציבות דינמית44,45,46,47. הרבה מידע זה הושג באמצעות מבינות כמו קריאות…
The authors have nothing to disclose.
אנו מודים לישי ג’ין ואנדרו צ’יזהולם על התמיכה הראשונית והמתח ששימש במחקר. זן החיידקים OP50 היה הועיל מסחרית מהמרכז לגנטיקה Caenorhabditis (CGC) במימון משרד NIH של תוכניות תשתית מחקר (P40 OD010440). אנו מודים גם לדהרמנדרה פורי על התקינה של ההליכים הניסיוניים. המחקר ממומן על ידי מענק הליבה של המרכז הלאומי לחקר המוח (נתמך על ידי המחלקה לביוטכנולוגיה, הממשלה של הודו), מענק קריירה מוקדמת של ברית הודו DBT/Wellcome Trust India (מענק # IA/E/18/1/504331) ל- S.D., מענק הביניים של ברית ברית הודו של Wellcome Trust-DBT (מענק # IA / IA / I/13/1/500874) ל- A.G.-R ומענק מוועדת המחקר המדעי וההנדסי (SERB: CRG/2019/002194) ל-א.ג.-ר
CZ18975 worm strain | Yishi Jin lab | CZ18975 | Generated by Anindya Ghosh-Roy |
Agarose | Sigma | A9539 | Mounting worms |
Coverslip (18 mm x 18 mm) | Zeiss | 474030-9010-000 | Mounting worms |
Dry bath with heating block | Neolab | Mounting worms | |
Glass slides (35 mm x 25 mm) | Blue Star | Mounting worms | |
Polystyrene bead solution (4.55 x 10^13 particles/ml in aqueous medium with minimal surfactant) | Polysciences Inc. | 00876 | Mounting worms |
Test tubes | Mounting worms | ||
OP50 bacterial strain | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | OP50 | Worm handling |
60mm petri plates | Praveen Scientific | 20440 | Worm handling |
Aspirator/Capillary | VWR | 53432-921 | Worm handling |
Incubator | Panasonic | MIR554E | Worm handling |
Platinum wire | Worm handling | ||
Stereomicroscope with fluorescence attachment | Leica | M165FC | Worm handling |
0.3% Sodium Chloride | Sigma | 71376 | Nematode Growth Medium |
0.25% Peptone | T M Media | 1506 | Nematode Growth Medium |
10mg/mL Cholesterol | Sigma | C8667 | Nematode Growth Medium |
1mM Calcium chloride dihydrate | Sigma | 223506 | Nematode Growth Medium |
1mM Magnesium sulphate heptahydrate | Sigma | M2773 | Nematode Growth Medium |
2% Agar | T M Media | 1202 | Nematode Growth Medium |
25mM Monobasic Potassium dihydrogen phosphate | Sigma | P9791 | Nematode Growth Medium |
0.1M Monobasic Potassium dihydrogen phosphate | Sigma | P9791 | 1X M9 buffer |
0.04M Sodium chloride | Sigma | 71376 | 1X M9 buffer |
0.1M Ammonium chloride | Fisher Scientific | 21405 | 1X M9 buffer |
0.2M Dibasic Disodium hydrogen phosphate heptahydrate | Sigma | S9390 | 1X M9 buffer |
Glass bottles | Borosil | Buffer storage | |
488 nm laser | Zeiss | Imaging | |
5X objective | Zeiss | Imaging | |
63X objective | Zeiss | Imaging | |
Camera | Photometrics | Evolve 512 Delta | Imaging |
Computer system for Spinning Disk unit | HP | Intel ® Xeon CPU E5-2623 3.00GHz | Imaging |
Epifluorescence microscope | Zeiss | Observer.Z1 | Imaging |
Halogen lamp | Zeiss | Imaging | |
Mercury Arc Lamp | Zeiss | Imaging | |
Spinning Disk Unit | Yokogawa | CSU-X1 | Imaging |
ZEN2 software | Zeiss | Imaging | |
Image J (Fiji Version) | Image analysis and processing | ||
Adobe Creative Cloud | Adobe | Image analysis and processing | |
Computer system for Image Analysis | Dell | Intel ® Core ™ i7-9700 CPU 3.00GHz | Image processing/Representation |