Crystallization of Proteins on Chip by Microdialysis for <i>In Situ</i> X-ray Diffraction Studies

Sofia Jaho; Niels Junius; Franck Borel; Yoann Sallaz-Damaz; Jean-Baptiste Salmon; Monika Budayova-Spano

doi:10.3791/61660

JoVE Journal > Chemistry

Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.

Kimya

Kristallisatie van eiwitten op chip door microdialyse voor in Situ röntgendiffractiestudies

Published: April 11, 2021

doi:

10.3791/61660

Sofia Jaho¹, Niels Junius^1,3, Franck Borel¹, Yoann Sallaz-Damaz¹, Jean-Baptiste Salmon², Monika Budayova-Spano¹

¹Université Grenoble Alpes, CEA, CNRS, IBS, ²CNRS, Solvay LOF, UMR 5258,Université Bordeaux, ³ELVESYS SAS

Özet

Dit artikel beschrijft het fabricageprotocol van microfluïdische chips ontwikkeld voor on-chip eiwitkristallisatie met de dialysemethode en in situ röntgendiffractie-experimenten. Het microfabricatieproces maakt het mogelijk om een semipermeabel geregenereerd cellulosedialysemembraan te integreren met elke moleculaire gewichtsafsnijd, tussen twee lagen van de chip.

Abstract

Dit protocol beschrijft de productie van reproduceerbare en goedkope microfluïdische apparaten die de hele pijpleiding bedekken voor het kristalliseren van eiwitten on-chip met de dialysemethode en het toestaan van in situ experimenten met enkelkristal of seriële kristallografie bij kamertemperatuur. Het protocol beschrijft het fabricageproces van de microchips, de manipulatie van de on-chip kristallisatie-experimenten en de behandeling van de ter plaatse verzamelde röntgendiffractiegegevens voor de structurele opheldering van het eiwitmonster. Het belangrijkste kenmerk van deze microfabrication procedure ligt op de integratie van een commercieel beschikbaar, semipermeabel geregenereerd cellulosedialysemembraan tussen twee lagen van de chip. De moleculaire gewichtsafsnul van het ingebedde membraan varieert afhankelijk van het molecuulgewicht van het macromolecule en de neerslagmiddelen. Het apparaat maakt gebruik van de voordelen van microfluïdische technologie, zoals het gebruik van minieme volumes monsters (<1 μL) en finetuning ten opzichte van transportverschijnselen. De chip koppelde ze aan de dialysemethode, die nauwkeurige en omkeerbare controle over het kristallisatieproces biedt en kan worden gebruikt voor het onderzoeken van fasediagrammen van eiwitten op de microliterschaal. Het apparaat is gemodelleerd met behulp van een fotocurable hars op basis van thiolene met zachte opdruklithografie op een optisch transparant polymeersubstraat. Bovendien werd de achtergrondverstrooiing van de materialen die de microchips vormen en achtergrondgeluid genereren geëvalueerd, waardoor de chip compatibel werd voor in situ röntgendiffractie-experimenten. Zodra eiwitkristallen op de chip zijn gekweekt tot een voldoende grootte en bevolkingsuniformiteit, kunnen de microchips direct voor de röntgenstraal worden gemonteerd met behulp van een 3D-geprinte houder. Deze aanpak pakt de uitdagingen aan die voortkomen uit het gebruik van cryoprotectanten en handmatige oogst in conventionele eiwitkristallografie-experimenten op een eenvoudige en goedkope manier. Complete röntgendiffractiegegevenssets van meerdere, isomorfe lysozymekristallen die op de chip werden gekweekt, werden verzameld bij kamertemperatuur voor structuurbepaling.

Introduction

Het ophelderen van de driedimensionale (3D) structuur van biologische macromoleculen is een onophoudelijke bezigheid in de structurele biologie waar röntgenkristallografie de belangrijkste onderzoekstechniek blijft. Toegepast voor het ontrafelen van de structurele details van complexe macromoleculen, zoals eiwitten, is het gericht op het vergemakkelijken van het begrip van hun mechanismen van acties en hun betrokkenheid bij verschillende biologische functies. Krachtige röntgenbronnen bij synchrotrons en röntgenvrije elektronenlasers (XFELs) bieden alle hulpmiddelen die nodig zijn voor een dieper inzicht in de structuur van de eiwitten bij bijna atoomresolutie. Ondanks de voordelen die gepaard gaan met het gebruik van röntgenstralen voor structurele studies, zijn er intrinsieke beperkingen aan röntgenstraling en het kristallisatieproces zelf. Stralingsschade veroorzaakt door hoge röntgenflux en lange belichtingstijden van het eiwitkristal voor de röntgenstraal zijn beperkende parameters die kristallografen moeten overtreffen met behulp van cryogene koeling¹. Het vinden van de optimale cryocoolingsomstandigheden kan echter bewerkelijk zijn, omdat conformatieveranderingen van de inheemse eiwitstructuur of artefacten kunnen worden verborgen²^,³. Bovendien blijkt uit recente studies dat het uitvoeren van diffractie-experimenten bij kamertemperatuur leidt tot lagere specifieke stralingsschade⁴. Een ander knelpunt in de structurele biologie is de verwerving van goed diffracerende kristallen met een voldoende grootte⁵. Kleine kristallen zijn gemakkelijker te produceren, vooral in het geval van membraaneiwitten, maar zijn vatbaarder voor stralingsschade, zelfs onder cryocoolingsomstandigheden, omdat een hoge stralingsdosis in een kleiner volume moet worden gericht in vergelijking met het geval van grotere eiwitkristallen⁶. De nieuwe benadering van seriële kristallografie⁷^,⁸ bij synchrotrons en XFELs kan de inperkingen van stralingsschade omzeilen en tegelijkertijd kleinere kristallen (200 nm tot 2 μm)⁷ benutten door datasets uit meerdere, isomorfe en willekeurig georiënteerde eiwitkristallen en profiterend van de bijbehorende technologische vooruitgang zoals femtosecondepulsen, kortere belichtingstijden en micro-gerichte röntgenstralen^5,^7,^9,¹⁰.

Microfluïdische technologie is waardevol voor röntgenkristallografie en vertoont talloze voordelen voor de kristallisatie van biologische macromoleculen en hun structureel onderzoek. Het uitvoeren van kristallisatie-experimenten in microfluïdische apparaten vereist kleine hoeveelheden eiwitmonsters, waardoor de productiekosten van deze hooggewaardeerde biomacromoleculen worden beperkt en screening en optimalisatie van talrijke kristallisatieomstandigheden met hoge doorvoer wordt vergemakkelijkt. Bovendien maken de inherente verhouding tussen groot oppervlak en volume op microfluïdische schaal en diffusieberegelde transportverschijnselen een fijne controle mogelijk over stromen en temperatuur – of concentratiegradiënten¹¹^,¹²^,¹³^,¹⁴, waardoor microfluïdische apparaten geschikt zijn voor het kweken van kristal van uniforme grootte en het verkennen van fasediagrammen¹⁵^,¹⁶^,¹⁷^,¹⁸^,¹⁹. Bovendien vertonen microfluïdische hulpmiddelen een onderscheidend potentieel om een andere hindernis in eiwitkristallografie aan te pakken, namelijk de levering van monsters, en de noodzaak om eiwitkristallen te hanteren en te oogsten voordat ze worden gebruikt voor röntgendiffractie-experimenten. De methode van on-chip en in situ röntgenkristallografie elimineert de kristalmanipulatie en de mogelijke verslechtering van de kristalkwaliteit voorafgaand aan het verzamelen van gegevens. Een breed scala aan microfluïdische chips die compatibel zijn voor in situ röntgeneiwitkristallografie zijn ontworpen, ontwikkeld en getest door vele onderzoeksgroepen die geconfronteerd worden met de gerelateerde beperkingen die voortvloeien uit de aard van de microfabricatiematerialen en hun interacties met röntgenstralen¹⁴^,^19,^20,^21,²²^,²³. De fabricagematerialen moeten optisch transparant, biologisch inert zijn en een hoge transparantie ten voordele van röntgenstraling en een optimale signaal-ruisverhouding tijdens het verzamelen van gegevens aantonen.

De meeste kristallisatiemethoden die worden toegepast in conventionele eiwitkristallografie²⁴^,²⁵ zijn ook geïmplementeerd op microfluïdische schaal^11,¹⁴ voor op chipkristallisatie en in situ röntgendiffractieanalyse. Eenvoudige, hybride of meerlagige microfluïdische apparaten met dampdiffusie^26,verdamping^27,vrije interfacediffusie (FID)^28,microbaat²⁶of zelfs zaaien²⁹ zijn gebruikt om oplosbare en membraaneiwitten te kristalliseren. Hoge doorvoer screening en optimalisatie van kristallisatie voorwaarden kan worden bereikt^30,³¹ in goed gebaseerde^32,druppel-gebaseerde^33,of klep-aangedreven³⁴ apparaten. Ter plaatse Röntgendiffractie-experimenten van uitdagende eiwitdoelen bij kamertemperatuur zijn uitgevoerd in microchips die zijn vervaardigd uit verschillende materialen zoals PDMS (polydimethylsiloxaan), COC (cyclisch olefinecopolymeer), PMMA (poly(methylmethacrylaat))²¹^,²²^,^26,²⁸^,²⁹, grafeenfilms²³, Kapton³⁵, epoxylijm⁶, of NOA (Norland Optical Adhesive)¹⁹ en de transparantie van de materialen voor röntgenstraling en hun bijdrage aan achtergrondgeluid zijn geëvalueerd. Bovendien zijn microchips ontworpen om de strategieën voor het verzamelen van seriële gegevens en de seriële gegevensverzameling te koppelen in één hulpmiddel voor experimenten met röntgeneiwitkristallografie bij synchrotronbronnen²³^,³⁵^,³⁶ en XFELs⁷.

Kamertemperatuur in situ dataverzameling is ook geïmplementeerd in verschillende leveringsmethoden en apparaten. Nogly et al.⁵⁴ gebruikten bijvoorbeeld een lipide kubieke fase (LCP) injector om de structuur van de lichtaangedreven fotonpompbacteriorhodopine (bR) te bestuderen door seriële femtoseconde kristallografie (SFX) met behulp van een XFEL-bron. De kristalstructuur van bR werd opgelost tot 2,3 Å-resolutie, wat de compatibiliteit van een LCP-injector met time-resolved seriële femtoseconde kristallografie (TR-SFX) aantoont. Baxter et al.⁵⁵ ontwierpen een multikristalraster met hoge dichtheid, vervaardigd door een 100 of 200 μm dik polycarbonaatplastic met lasergesneden gaten van verschillende grootte. Een extra 5 μm dikke polycarbonaatfilm kan aan één kant van het rooster worden bevestigd wanneer het apparaat wordt gebruikt voor zit- of ophangdruppelkristallisatie-experimenten. Dit raster met hoge dichtheid kan op meerdere manieren worden gebruikt, omdat kristallen rechtstreeks op de poorten van het apparaat kunnen worden geladen of kristallen op het apparaat kunnen worden gekweekt door dampdiffusie of de LCP-methode. Bovendien kan het raster worden aangepast in een standaard magnetische basis en worden gebruikt voor het verzamelen van röntgengegevens in situ bij cryogene of kamertemperatuuromstandigheden. Meer recent ontwikkelden Feiler et al.⁵⁶ een monsterhouder voor macromoleculaire in situ röntgenkristallografie bij cryogene en omgevingstemperatuur met minimale bijdrage aan achtergrondgeluid. Concreet bestaat de houder uit een kunststof steun, een transparante COC folie en een microporeuze gestructureerde polyimide folie. Het werd ontworpen om de veelgebruikte afdekglaasjes te vervangen voor het instellen van kristallisatiedruppels, terwijl manipulatie op zijn plaats mogelijk was, zoals ligand soaking, complexe vorming en cryogene bescherming zonder de kristallisatiedruppel te openen of de kristallen handmatig te hanteren. Bovendien kan de monsterhouder van de kristallisatieplaat worden verwijderd en op een magnetische basis worden geplaatst voor het verzamelen van in situ-gegevens bij standaard op goniometer gebaseerde bundellijnen. Voor het verzamelen van omgevingstemperatuurgegevens wordt de COC-folie vóór het experiment verwijderd en draagt alleen de 21 μm dikke polyimidefolie bij aan achtergrondverstrooiing, wat in dit geval minimaal is. Deze voorbeelden vormen slechts een klein deel van het lopende onderzoek en de veelheid aan veelzijdige microchips die zijn ontwikkeld voor röntgeneiwitkristallografie.

De methode voor kristallisatie van dialyse-eiwitten is echter niet op grote schaal opgenomen in microfluïdica. Dialyse is een op diffusie gebaseerde methode die gericht is op het evenwicht van de neerslagconcentratie door een semipermeabel membraan om de nominale concentratie voor eiwitkristallisatie te benaderen en nauwkeurige en omkeerbare controle over de kristallisatieomstandigheden mogelijk maakt²⁴. De Molecular Weight Cut-Off (MWCO) van het semi-permeabele dialysemembraan kan worden gekozen afhankelijk van het molecuulgewicht van het macromolecule en de neerslagmiddelen om de diffusie van kleine neerslagmoleculen mogelijk te maken met behoud van het macromolecule van belang. Vanwege de omkeerbaarheid van het dialyseproces kan het worden gebruikt in combinatie met temperatuurregeling om nucleatie en kristalgroei onafhankelijk te ontkoppelen en te optimaliseren³⁷ voor het onderzoeken van fasediagrammen door de neerslagconcentratie te wijzigen terwijl hetzelfde eiwitmonster wordt gebruikt. De integratie van membranen in microfluïdica wordt beoordeeld door de Jong et al.³⁸ en de casestudy’s in de biologie die dialyse in microchips implanteren, kunnen voornamelijk worden vermeld in monstervoorbereidings -, concentratie – of filtratietoepassingen³⁹^,⁴⁰,⁴¹^,⁴² of celgerelateerde studies⁴³^,⁴⁴. Pervaporatie via PDMS werd gebruikt door Shim et al.³⁷ om de nucleatie en groei van xylanase in verschillende omstandigheden te bestuderen. Water doordrong door het 15 μm dikke PDMS-membraan in het eiwitreservoir van het microfluïdische apparaat en veranderde vervolgens de eiwit- en neerslagconcentratie.

Het protocol ontwikkeld door Junius et al.¹⁹^,⁴⁵ voor de fabricage van een microfluïdische chip compatibel voor zowel on-chip eiwit kristallisatie via microdialyse en in situ röntgendiffractie experimenten bij kamertemperatuur wordt gepresenteerd. Het protocol voor de fabricage van het apparaat is direct geïnspireerd op het baanbrekende werk van Studer en collega’s¹²^,⁴⁶ voor micro-patroonstickers van foto-uithardende hars op basis van thiolene NOA 81 die commercieel verkrijgbare membranen insluit, met behulp van zachte opdruklithografie. Een innovatieve wijziging van de methode resulteerde in microchips die het gebruik van microdialyse mogelijk maakten om de experimentele parameters voor de on-chip groei van eiwitkristallen nauwkeurig te monitoren en te controleren en tegelijkertijd de voordelen van microfluïdica te benutten, zoals verminderde consumptie van eiwitmonsters per experiment (20 μL) voor het screenen en optimaliseren van kristallisatieomstandigheden door temperatuurprecipitante concentratiefasediagrammen in kaart te brengen⁴⁷. In dit werk wordt een protocol beschreven voor de productie van dialysemicrochips met geregenereerde cellulose (RC) dialysemembranen van verschillende MWCO om kristallisatietests uit te voeren op chip en in situ x-ray diffractiegegevensverzameling. De materialen bestaande uit de microchips zijn beoordeeld op hun transparantie tot röntgenstralen¹⁹ en de apparaten kunnen direct voor de röntgenstraal worden ingesteld voor experimenten met kamertemperatuur in situ diffractie, met uitzondering van de handmatige hantering en het minimaliseren van de afbraak van kwetsbare eiwitkristallen. In een case study werden kippeneiwitte lysozymekristallen on-chip gekweekt via microdialyse die een uniforme populatie genereerde. De microchip werd vervolgens voor de röntgenstraal gemonteerd met een 3D-geprinte ondersteuning¹⁹ en complete in situ diffractiegegevenssets werden verzameld bij kamertemperatuur uit meerdere, isomorfe kristallen, wat het hoge potentieel en de relevantie van de chips aantoonde voor synchrotron seriële kristallografiestudies van uitdagende macromoleculaire doelen.

Protocol

1. Maskerontwerp en meesterfabricage Teken de gewenste geometrieën van het microfluïdische apparaat met behulp van vectoriële tekensoftware. Bereid voor elke laag van de fotoresist die wordt gebruikt voor de volgende stap van de fotolithografie een individueel masker voor: één masker omlijnd met kanalen en pilaren en één masker dat alleen de pilaren bevat. Vertaal de CIF-bestanden die door de tekensoftware worden gegenereerd naar filmfotomaskers. Dit kan via commerciële diensten. Vereist het juiste fotomasker, afhankelijk van de keuze van de fotoresist die tijdens de fotolithografie wordt gebruikt.OPMERKING: Bestel voor de SU-8 fotoresist maskers met zwarte kenmerken op een transparante achtergrond. SU-8 is een negatieve fotoresist op epoxybasis, wat betekent dat tijdens de blootstelling aan UV-licht (365 nm) de aan UV blootgestelde delen worden gekruist terwijl de rest oplosbaar blijft. Daarom worden alle zwarte patronen op het masker niet gekruist door UV-licht tijdens de fotolithografie. Kanalen en pilaren worden gegraveerd op de meesters. Bereid twee meesters voor op siliciumwafels voor het ontwerp van elke chip door fotolithografie met behulp van SU-8 negatieve fotoresist.OPMERKING: De stappen 1.3.1-1.3.7 worden uitgevoerd in een schone ruimte. De onderstaande stappen zijn de traditionele stappen van fotolithografie gevolgd door PDMS zachte lithografie, die in veel studieboeken worden beschreven. Alle waarden van de experimentele parameters (fotoresist, tijdsduur, temperatuur, enz.) zijn afhankelijk van veel subtiele parameters en moeten worden geoptimaliseerd afhankelijk van de verschillende gebruikte apparaten. Gebruik een 3-inch siliciumwafel en behandel het oppervlak met plasma gedurende 90 s, om de afzetting en bevestiging van de SU-8 fotoresist te vergemakkelijken. Giet ongeveer 3 ml SU-8 weerstand in het midden van de wafer en draai de SU-8 tot de gewenste dikte (figuur 1A). Gebruik voor 50 μm nominale dikte SU-8 3050 en spincoat voor 10 s bij 500 tpm en achtereenvolgens 30 s bij 3500 tpm. Bak de fotoresist zachtjes 15 minuten op een kookplaat op 368 K om gedeeltelijk gestold te worden door het oplosmiddel in de hars te laten verdampen en te voorkomen dat het op het fotomasker blijft plakken. Laat daarna de wafel op kamertemperatuur gedurende 2 minuten staan. Stel de fotoresist bloot aan UV-licht (figuur 1B). Gebruik een masker aligner met een vermogen van 35 mW cm-2 en 8 s belichtingstijd. Ga verder met het bakken na blootstelling. Plaats de wafel op een kookplaat gedurende 5 minuten op 368 K om de fotoreactie te voltooien die wordt aangeroepen door de UV-belichting. Verwijder alle SU-8 weerstand die niet was gekruist door het plaatsen van de wafer in een bad met propyleenglycol methyl etheracetaat (PGMEA) en roer gedurende 15 minuten. Spoel de wafer af met isopropanol totdat er geen wazige neerslag kan worden waargenomen. Droog de wafel met stikstofgas en bewaar deze in een Petrischaal (standaardformaat 100 mm x 15 mm). Behandel het oppervlak van de wafer met een silaan om het losmaken van polydimethylsiloxaan (PDMS) te vergemakkelijken dat zal worden gebruikt om 2 stempels te fabriceren. Deponeer de wafel op een getapte kookplaat op 368 K gedurende 10 minuten onder de dampatmosfeer van hexamethyldisilazane (HMDS).OPMERKING: Als het afpellen van het PDMS van de wafer na meerdere toepassingen moeilijk wordt, moet het oppervlak van de wafer opnieuw worden behandeld met HMDS-damp. De eerste master met de kanalen en de pilaren is klaar. Herhaal deze stappen en bereid de tweede master patterning alleen de pilaren voor.OPMERKING: Tijdens de fotolithografie is het doel om de geometrieën van het apparaat op de SU-8-masters te verkrijgen met een hoogte van 50 μm. Zodra de twee SU-8-meesters zijn vervaardigd, meet u echter de hoogte van de geometrieën die op de masters zijn gegraveerd met een profilometer om de experimentele waarde te verkrijgen. De gemeten waarde voor beide SU-8-masters die voor dit protocol zijn vervaardigd, is ongeveer 45 μm. 2. PDMS mallen fabricage OPMERKING: De volgende stappen van het protocol kunnen in elk laboratorium worden uitgevoerd zolang een laminaire stroomkap wordt gebruikt, geel licht in de kamer wordt gebruikt bij het werken met de NOA 81-hars (stappen 3.6-3.11) en er is een bron van UV-licht beschikbaar voor het polymeriseren van de NOA 81-hars (stappen 3.7 en 3.11). Bereid 50 g PDMS-siliconenbasis en het uithardingsmiddel in een massaverhouding van 10:1. Meng beide ingrediënten in een bekerglas met een spatel en plaats het mengsel in een vacuümkamer om alle luchtbellen te verwijderen. Giet 25 g van het voorgemixte PDMS in de SU-8-master (opgeslagen in een Petrischaal) met een patroon van de kanalen en de pilaren tot een hoogte van ongeveer 5 mm. Giet de resterende 25 g van het PDMS in de tweede SU-8 master patterning alleen de pilaren tot een hoogte van ongeveer 5 mm (Figuur 1C). Zet beide Petri gerechten in een oven en hard de PDMS lagen uit op 338 K gedurende 1 uur. Snijd de uitgeharde PDMS-laag rond de patronen van de SU-8-meesters met een scalpel en pel voorzichtig de PDMS-mallen van de meesters af (figuur 1D).OPMERKING: De hierboven beschreven procedure, replica molding genaamd, wordt vaak gebruikt om mallen van PDMS voor te bereiden die aan glasoppervlakken worden bevestigd en deel uitmaken van een microfluïdisch apparaat53. In dit protocol maken de PDMS-mallen geen deel uit van de chip, maar worden ze gebruikt als tussenproducten voor de chipfabricage. Voor elk ontwerp worden 2 PDMS-mallen gemaakt van de respectieve SU-8-masters(figuren 1D en 1E)en zullen dienovereenkomstig worden gebruikt (zoals hieronder beschreven) voor de fabricage van de microchip. 3. Dialyse chip fabricage Plaats de PDMS-mal met zowel de kanalen als de pilaren op een stijve glazen dia van de microscoop (3 x 1 in. standaardformaat) met de patronen naar boven gericht (figuur 1F). De centrale pijler die overeenkomt met het eiwitreservoir overschrijdt verticaal 45 μm van het horizontale oppervlak van de PDMS-mal. Snijd en scheid een droog stuk van het geregenereerde cellulose (RC) dialysemembraan en deponeer het op de centrale pijler van de PDMS-mal, die op de glazen glijbaan wordt ondersteund(figuur 1F).OPMERKING: Het RC-dialysemembraan is in de handel verkrijgbaar en de moleculaire gewichtsafsnul (MWCO) wordt dienovereenkomstig gekozen met het molecuulgewicht van het onderzochte eiwit en de gebruikte neerslagmiddelen. De grootte van het stuk van het RC dialysemembraan hangt af van het ontwerp van de chip. In dit protocol zijn 2 prototypes ontworpen waarbij het volume van het eiwitreservoir 0,1 of 0,3 μL is. In deze gevallen is de grootte van het dialysemembraanstuk respectievelijk 2 x 2 mm2 of 4 x 4 mm2. Plaats de tweede PDMS-malpatroon alleen de pilaren naar beneden gericht op de PDMS-mal die op de glazen dia wordt ondersteund(figuur 1F). De centrale pijler van deze mal komt overeen met het eiwitreservoir en overschrijdt verticaal (naar beneden gericht) met 45 μm van het horizontale oppervlak. Lijn de centrale pijlers van de 2 PDMS-mallen uit. Het RC-dialysemembraan is “ingeklemd” tussen de 2 PDMS-mallen (figuur 1G).OPMERKING: De uitlijning tussen de microstructuren van de 2 PDMS-mallen kan visueel worden uitgevoerd, zonder extra apparatuur. Anders kan deze manipulatie onder een microscoop worden bereikt. Een kleine verschuiving tussen de reservoirs is niet problematisch, zolang het vloeistofkanaal en de ingangs- of uitgangspunten niet volledig zijn bedekt. Desiccateer de assemblage gedurende 30 minuten in een vacuümkamer om alle opgesloten luchtbellen in de PDMS-mallen te verwijderen en het inbrengen van de hars tijdens de volgende stap van de fabricage te bevorderen.OPMERKING: De 2 PDMS-mallen worden op hun plaats gehouden door PDMS-PDMS-hechting en er is geen extra druk of andere manier van tijdelijke hechting nodig. Vul de lege ruimte tussen de 2 PDMS-mallen met de fotocurable hars noa 81 op basis van thiolene door capillaire imbibitie(figuur 1H en 1I). Hard de hars uit door blootstelling aan UV-licht (365 nm) gedurende 8 s met behulp van een gebotste UV-lamp (vermogen 35 mW cm-2).OPMERKING: Met deze eerste blootstelling kan NOA 81-hars gedeeltelijk worden gekruist, omdat een dunne laag NOA 81 in contact met de PDMS-mallen aan beide zijden onbeveiligd blijft. Snijd het overschot van NOA 81 van de buitenkant van de PDMS-mallen met een scalpel. Verwijder de bovenste PDMS-mal met de gedeeltelijk gekruiste NOA 81 erop geplakt van de onderste PDMS-mal en de glazen glijbaan. Snijd een 175 μm dikke PMMA-plaat in de standaardafmetingen van een microscoopglasschuif (3 x 1 inch) en verwijder de plastic beschermingsplaten van elke kant van het PMMA-stuk. Druk voorzichtig op de montage van de bovenste PDMS-mal en de gedeeltelijk uitgeharde NOA 81 op het PMMA-stuk (figuur 1J). Hard noa 81 opnieuw uit door blootstelling aan UV-licht gedurende 60 s en verwijder de bovenste PDMS-mal(figuur 1K). De hars hecht zich zonder verdere behandeling aan het PMMA-substraat.OPMERKING: De PDMS-mallen kunnen ongeveer tot 5 keer worden hergebruikt na het wassen met isopropanol en aceton, zolang de mallen niet gebogen zijn. Het RC dialysemembraan is verwerkt in de NOA 81 sticker en verdere manipulatie of mechanische klemming is niet nodig. 4. Vloeiende connectoren OPMERKING: Het ontwerp van de microfluïdische chip bestaat uit een lineair vloeibaar kanaal voor de kristallisatieoplossing en een centraal reservoir voor het eiwitmonster (eiwitreservoir), beide weergegeven vanuit een bovenaanzicht van twee microchips in figuur 2A. Een RC-dialysemembraan is ingebed tussen deze twee microstructuren (figuur 2D) en het kristallisatieproces evolueert terwijl neerslagmiddelen uit de kristallisatieoplossing over het membraan diffunderen als gevolg van een concentratiegradiënt tussen de twee compartimenten van de chip die door het membraan worden gescheiden. Het microfluïdische kanaal is ingeprent op de onderste PDMS-mal(figuur 1F). Zodra het fabricageprotocol voor de chips is voltooid, bevindt het lineaire kanaal zich op de onderste laag van de NOA 81-sticker in contact met het PMMA-substraat, zoals weergegeven in figuur 1K. Een inlaat en een uitlaattoegangspunt voor de kristallisatieoplossing bevinden zich aan elk uiteinde van het lineaire kanaal en zien eruit als gaten (totale hoogte 90 μm) zoals te zien is in figuur 2A. Voor de verwerking van de kristallisatieoplossing moeten connectoren op de toegangspunten worden toegevoegd. Lijmconnectoren die in de handel verkrijgbaar zijn (NanoPort) op de in- en uitlaat van het microfluïdische kanaal met snelle epoxylijm (figuur 2C). Kies de juiste diameter van de PTFE-buizen op basis van de grootte van de connectoren. De PTFE-buizen worden gebruikt voor de introductie van de kristallisatieoplossing in het vloeistofkanaal van de chip.OPMERKING: In de handel verkrijgbare kits worden aanbevolen voor eenvoudige en nauwkeurige controle over het debiet en worden meestal gecombineerd met geautomatiseerde drukaangedreven of debietgestuurde (spuitpompen) systemen voor mengen en vloeistofbehandeling. De kristallisatieoplossing kan echter handmatig in het lineaire kanaal worden geïntroduceerd met een plastic wegwerpspuit. In dit geval worden stap 4.3 tot en met 4.5 voorgesteld. Vul een wegwerpspuit van 1 ml met de kristallisatieoplossing. Voor de chips in dit protocol is 400 μL voldoende om het hele vloeistofkanaal te vullen. Snijd twee pipetpunten zodat de diameter van de punt aan één kant gelijk is aan de binnendiameter van de PTFE-buis die zal worden gebruikt voor het hanteren van de oplossing. Lijm de bijgesneden uiteinden op de toegangspunten van het kanaal met snelle epoxylijm (figuur 2B). Sluit de spuit aan met de bijgesneden uiteinden met een stuk PTFE-buis van de juiste grootte en introduceer de oplossing in het kanaal door de zuiger van de spuit constant langzaam te duwen. 5. Eiwitinkap OPMERKING: Het patroon van de chip die wordt gebruikt als eiwitreservoir blijft zo ver open voor de atmosfeer. Het volgende protocol wordt voorgesteld om het eiwitmonster in de microfluïdische chip zorgvuldig te beperken. Pipetteer handmatig een druppel van het eiwitmonster in het eiwitreservoir, direct op het RC-dialysemembraan, zoals geïllustreerd in figuur 2E. Het volume van het eiwitmonster varieert afhankelijk van het ontwerp van de chip en kan 0,1 of 0,3 μL zijn. Breng een dunne laag hoogvacuüm siliconenvet aan rondom het eiwitreservoir. Snijd een klein stukje van een 175 μm dik PMMA-vel en plaats het voorzichtig boven de dunne laag van het siliconenvet. Het PMMA-stuk moet het hele oppervlak van het eiwitreservoir bedekken waar de eiwitoplossing wordt afgezet.OPMERKING: Het siliconenvet wordt gebruikt om de luchtdichtheid te verbeteren en de verspreiding van de eiwitdruppel te voorkomen. Er is geen hechting of afdichting tussen het PMMA-stuk dat wordt gebruikt voor het bedekken van het eiwitreservoir en de NOA 81-sticker. Het contact tussen hen is een solide / solide interface. Om een algehele afdichting en een luchtdichte inkapseling van het eiwitmonster te produceren, wordt een stuk Kapton-tape gebruikt zoals beschreven in stap 5.4.OPMERKING: Het is soms moeilijk om het eiwitmonster in de speciale holte van het apparaat (eiwitreservoir) te beperken wanneer een drukgestuurd systeem wordt gebruikt voor de introductie van de kristallisatieoplossing in het vloeistofkanaal (stap 6.4). Om het hierboven genoemde probleem te voorkomen, moeten relatief lagedrukwaarden worden gehandhaafd tijdens het circuleren van de kristallisatieoplossing. Een injectiedruk van 20-60 mbar voor waterige oplossingen of 50-150 mbar voor meer viskeuze oplossingen (PEGs, glycerol) wordt voorgesteld19. Snijd een stuk Kapton-tape (20 μm dik) groot genoeg om het PMMA-stuk boven het eiwitreservoir te bedekken en aan alle randen op de NOA-chip te plakken. Het eiwitmonster wordt ingekapseld in het reservoir en de chip is klaar om te worden gebruikt voor het kristallisatie-experiment, zoals weergegeven in figuur 2C.OPMERKING: De chips kunnen meerdere keren worden hergebruikt zolang het dialysemembraan en de hechting van NOA op het PMMA-substraat niet verslechteren. Als deze delen van de chip beschadigd zijn, worden lekken waargenomen die controleren of het apparaat niet meer kan worden gebruikt. Het wassen van de chips hangt af van de kristallisatieoplossing. In het geval van oplossingen met een lage viscositeit (zouten, buffers) kan het vloeistofkanaal worden gewassen door alleen gedestilleerd water in te voeren en het een paar minuten te laten stromen. 400 μL is het volume dat nodig is om een oplossing binnen het kanaal volledig te kunnen vervangen door een andere oplossing. In het geval van meer stroperige oplossingen (PEGs, glycerol) wordt hergebruik van de chips niet aanbevolen, omdat het wassen van het kanaal alleen met water niet voldoende is. Het bovenste deel van de chip, waar het eiwitreservoir zich bevindt, kan ook worden gewassen met gedestilleerd water en worden gedroogd met lucht onder druk. 6. On-chip eiwitkristallisatie Weeg lyophilized kip eiwit lysozyme poeder en los op in gedestilleerd water om een uiteindelijke concentratie van 30 mg ml-1te verkrijgen. Filter de eiwitoplossing door een filter van 0,22 μm en centrifugeer gedurende 5 minuten op de hoogste snelheid bij 293 K om alle vaste deeltjes te verwijderen. Gebruik de supernatant voor het kristallisatie-experiment. Bereid 500 μL kristallisatieoplossing met de buffer en het neerslag in concentraties in tabel 1. Filter de oplossing door een filter van 0,22 μm. Injecteer de oplossing in het inlaatpunt van de chip met een spuit of een geautomatiseerd drukaangedreven vloeistofsysteem of een spuitpomp, zoals beschreven in stap 4.1-4.5.OPMERKING: Het kristallisatie-experiment kan plaatsvinden onder statische toestand, als het microfluïdische kanaal is gevuld met de kristallisatieoplossing en opzij wordt gezet, of onder vloeiende omstandigheden, als het continu in het kanaal wordt geïnjecteerd met een constant debiet. Voor het laatste geval wordt het gebruik van een extern drukgestuurd systeem of spuitpomp aanbevolen. De realisatie van het experiment onder vloeiende omstandigheden biedt ook de mogelijkheid om kristallisatieoplossingen dynamisch uit te wisselen binnen het vloeiende kanaal. Zo kunnen meerdere experimenten worden uitgevoerd met hetzelfde eiwitmonster. Zodra het vloeistofkanaal is gevuld met de kristallisatieoplossing, sluit u de inlaat- en uitlaatpoorten van de chip af met parafilmtape. Pipetteer het juiste volume van de eiwitoplossing in het eiwitreservoir en vat het eiwitmonster in zoals beschreven in stap 5.1-5.4. Bewaar de chip op 293 K.OPMERKING: Kristallisatie via dialyse volgt een ander kinetisch traject dan experimenten uitgevoerd met de dampdiffusiemethode of batchkristallisatie en hangt sterk af van de aard van neerslagmoleculen die betrokken zijn bij het diffusieproces, volgens gemeten gegevens51, en het kan meer tijd kosten voordat de nucleatie begint. Om eventuele verdamping te voorkomen, plaatst u de chip in deze periode in een verzadigde atmosfeer met een luchtvochtigheid van 293 K. 7. In situ en on-chip röntgendiffractie 3D-geprinte ondersteuning voor li lijnen Druk de ondersteuning af die maximaal drie chips tegelijk kan dragen. De afmetingen van de steun zijn dezelfde als de afmetingen van commerciële kristallisatieplaten (96 well/SBS-standaard) die compatibel zijn met röntgendiffractie-experimenten met platen.OPMERKING: Het afdrukken van de ondersteuning kan worden toegewezen aan commerciële diensten. De ondersteuning is ontworpen met behulp van een 3D-CAD-ontwerpsoftware en wordt getoond in figuur 3A tijdens experimenten met on-chip eiwitkristallisatie en in figuur 3B tijdens het verzamelen van röntgendiffractiegegevens in situ bij BM30A-FIP (ESRF). Stabiliseer de dialysechips op de steun met een enkel- of dubbelzijdige tape. Ter plaatse Röntgendiffractie Verzamel röntgendiffractiegegevens bij kamertemperatuur van kristallen die in het eiwitreservoir worden gekweekt. Gebruik bijvoorbeeld röntgenstralen met een energie van 12.656 keV, een flux van 3,32 x 1010 fotonen s-1 en een bundelgrootte van 250 x 250 μm2. Neem de diffractiebeelden op met een ADSC Quantum 315r-detector met een matrix van 3 x 3 CCD voor een actief oppervlak van 315 x 315 mm2 en 9,4 megapixels.OPMERKING: De diffractiegegevens voor de lysozymekristallen die op de dialysechips worden gekweekt, zijn verzameld op BM30A-FIP-bundellijn in de European Synchrotron Radiation Facility (ESRF). De bundelgrootte, de flux en het detectortype kunnen echter verschillen in andere röntgenstralingsbronnen. De 3D-geprinte ondersteuning maakt gegevensverzameling mogelijk met een hoekbereik van -40° tot +40° rond het kristal. Het aantal lysozymekristallen dat wordt blootgesteld voor het verzamelen van in situ-gegevens, het aantal diffractiepatronen dat voor elk kristal wordt verzameld, het oscillatiehoekbereik per blootstelling en de belichtingstijd zijn samengevat in tabel 2. Gegevensbehandeling Verwerk de volledige of gedeeltelijke datasets met de diffractiepatronen voor de lysozymekristallen met het XDS-programma48. Genereer het HKL-bestand voor elke gegevensset en schaal ze met behulp van de XSCALE-software48. Gebruik moleculaire vervanging met het programma Phaser van de CPP4 suite49 en bepaal de fasen voor modelbouw. Gebruik voor deze stap de bekende 3D-coördinaten van lysozyme uit de Protein Data Bank (PDB) entry 193L. Verfijn de structuur met Behulp van Phenix52 en inspecteer het uiteindelijke eiwitmodel met behulp van COOT50.

Representative Results

De microfluïdische chips ontwikkeld door Junius et al.19,45 zijn compatibel voor zowel on-chip eiwitkristallisatie met de microdialysemethode als in situ röntgendiffractiegegevensverzameling bij kamertemperatuur. Foto’s van de microchips, hun gedetailleerde ontwerp, de vloeistofconnectoren en het RC-dialysemembraan zijn geïllustreerd in figuur 2. De kristallisatie-experimenten worden opgezet door het eiwitmonster handmatig rechtstreeks in het eiwitreservoir te spuiten en de kristallisatieoplossing in het lineaire vloeistofkanaal te introduceren met een geautomatiseerd drukgestuurd systeem of spuitpomp of handmatig met behulp van een spuit. Het eiwitreservoir en het vloeistofkanaal zijn te onderscheiden in figuur 2A. Ontwerpen voor het fabriceren van chips met een maximaal volume van 0,1 μL of 0,3 μL van het eiwitreservoir zijn respectievelijk weergegeven in figuur 2A links en rechts. Chips met een maximale capaciteit van 0,2 μL of 0,7 μL voor het eiwitmonster worden elders vermeld19. Het hoogtepunt van het protocol voor de fabricage van het apparaat kan worden beperkt op het gebruik van de fotocurable hars op basis van thiolene NOA 81 die commercieel verkrijgbare RC-dialysemembranen van verschillende MWCOs insluit. Tijdens de fabricage van de microfluïdische apparaten wordt het lineaire vloeistofkanaal op de onderste PDMS-mal(figuur 1F)gedrukt, terwijl de bovenste PDMS-mal alleen bestaat uit de patroonpijlers voor het eiwitreservoir en de inlaat- en uitlaatpoorten(figuur 1F). Zodra NOA 81 is gekruist en de PDMS-mallen uit de assemblage zijn verwijderd(figuur 1K),bevindt het vloeistofkanaal zich op de onderste laag van de microchip en bevinden het eiwitkanaal en de inlaat-/uitlaatpoorten zich op beide lagen. Figuur 1L illustreert een zijaanzichtschema van de dialysechip waarbij alle lagen van het apparaat en hun respectieve dikte worden aangegeven. De hoogte van de patronen op de onderste laag van de chips (vloeibaar kanaal) is ongeveer 45 μm, terwijl de totale hoogte van de inlaat- en uitlaatpoorten ongeveer 90 μm is. Het eiwitreservoir (45 μm hoogte) is ook geïllustreerd in figuur 2D en 2E. De uitlijning van de twee lagen werd onderzocht onder een optische microscoop en het deel van het RC-dialysemembraan dat in de microchip is opgenomen, kan duidelijk worden onderscheiden in figuur 2D. In dezelfde figuur is lucht in het vloeistofkanaal gestoken tijdens de injectie van de kristallisatieoplossing, zoals te zien is in het linkerbovengedeelte van het eiwitreservoir. Figuur 2E is een close-upfoto van het eiwitreservoir na de handmatige afzetting van de eiwitdruppel met een pipet en vóór de inkapseling van de druppel met een stuk PMMA en Kapton-tape, zoals beschreven in stap 5.2 en 5.3 van het protocol. De microfluïdische chip die klaar is om te worden gebruikt voor kristallisatie-experimenten, na de inkapseling van het eiwitmonster en het lijmen van de vloeistofconnectoren, is afgebeeld in figuur 2C. De luchtdichte montage zorgt ervoor dat er geen lekkages kunnen optreden. De vloeistofconnectoren voor de inlaat- en uitlaatpoorten van het microfluïdische kanaal kunnen ofwel de in de handel verkrijgbare connectoren zijn zoals beschreven in stap 4.1 van het protocol en weergegeven in figuur 2C,of wegwerplaboratoriumpipetpunten kunnen voor hetzelfde doel worden gebruikt(figuur 2B,protocolstap 4.4). Voor de fabricage van de microfluïdische chips werd gekozen voor optisch transparante en biologisch inerte materialen, die een hoge compatibiliteit aantonen voor in situ röntgendiffractie-experimenten bij kamertemperatuur. De interacties van röntgenstralen, absorptie en verstrooiing, waarbij de materialen die het microfluïdische apparaat vormen en de omringende atmosfeer (lucht) een signaal genereren dat bekend staat als achtergrondgeluid. Dit geluid vat het diffractiesignaal samen van de eiwitkristallen die door de detector zijn geregistreerd, waardoor de signaal-ruisverhouding vervalt en zo laag mogelijk moet worden gehouden tijdens het verzamelen van röntgendiffractiegegevens. We hebben het achtergrondgeluid geëvalueerd dat wordt gegenereerd door de materialen die het eiwitreservoir vormen, dat zich in het directe pad van de röntgenstraal bevindt. Het eiwitreservoir bestaat uit het RC-dialysemembraan, de Kapton-tape en twee PMMA-stukken, één gebruikt als substraat voor de microchip en één gebruikt voor de inkapseling van het eiwitmonster. De dikte van de PMMA is 2 x 175 μm, van de Kapton tape 20 μm, en het RC dialysemembraan is ongeveer 40 μm dik(figuur 1L). De totale dikte van deze lagen is ongeveer 410 μm en de NOA 81-laag bevindt zich niet in het directe röntgenpad. Afgezien van de dikte van de fabricagematerialen, is hun dichtheid ook cruciaal voor het meten van het achtergrondverstrooiingsgeluid, omdat röntgenverstrooiing toeneemt met het elementaire atoomnummer. Om deze reden werd heliumflux (een functie van BM30A-FIP bij ESRF) gebruikt in plaats van lucht tijdens de gegevensverzameling voor materiaalkarakterisering en voor experimenten met eiwitdiffractie. Figuur 3C illustreert het achtergrondgeluid dat wordt gegenereerd door de Kapton-tape, het RC-dialysemembraan, het PMMA-blad en hun assemblage in heliumatmosfeer. Elk materiaal werd gedurende 20 s blootgesteld aan röntgenstralen van 0,98 Å golflengte en de afstand van de monsterdetector was 200 mm. De experimenten werden uitgevoerd bij de BM30A-FIP beamline bij ESRF, zoals uitgelegd in stap 7 van het protocol. Diffuse ringen die worden toegeschreven aan de interacties van de röntgenstraal met de materialen kunnen worden onderscheiden voor de Kapton-tape met een resolutie lager dan 4 Å, de PMMA-plaat tussen 4-8 Å en het dialysemembraan tussen 4-5 Å-resolutie. Het achtergrondgeluid dat door de dialysechip wordt gegenereerd, wordt voornamelijk waargenomen bij een resolutie lager dan 6 Å die geen invloed heeft op de behandeling van diffractiegegevens met hoge resolutie van de grote lysozymekristallen. De intensiteit van de achtergrondverstrooiing als functie van de resolutie voor de microchip en de afzonderlijke materialen wordt elders weergegeven19. In de in figuur 3Cgepresenteerde meting was de dialysechip leeg van een oplossing (eiwit- of neerslagoplossing) en is de bijdrage van de aanwezigheid van oplossing aan het achtergrondgeluid niet gemeten. De chips werden voor de röntgenstraal gemonteerd met een 3D-geprinte ondersteuning (figuur 3B) ontworpen voor in situ diffractie-experimenten19. Dezelfde ondersteuning met afmetingen gelijk aan de afmetingen van een 96-put/SBS standaard kristallisatieplaat, kan echter worden gebruikt voor het gelijktijdig uitvoeren van 1 tot 3 kristallisatie-experimenten, omdat deze tot 3 chips tegelijkertijd kan bevatten(figuur 3A). Experimenten werden uitgevoerd om de efficiëntie van de microfluïdische apparaten voor de on-chip kristallisatie van modeloplosbare eiwitten met de microdialysemethode te evalueren. Het vloeistofkanaal werd gevuld zoals beschreven in stap 4 van het protocol, terwijl stap 5 en 6 beschreven hoe het eiwitmonster in het speciale eiwitreservoir kon worden ingekapseld en hoe de kristallisatie-experimenten moesten worden opgezet. Figuur 4 toont lysozymekristallen gekweekt bij 293 K onder 1,5 M natriumchloride (NaCl) met 0,1 M natriumacetaat (CH3COONa) pH 4,0 (A) en minder dan 1 M NaCl, 0,1 M CH3COONa pH 4,5 met 30% polyethyleenglycol (PEG) 400 (B). Het gelyophiliseerde lysozympoeder werd opgelost in water tot een uiteindelijke concentratie van ~30 mg ml-1 of in 20 mM CH3COONa pH 4,2 buffer tot een uiteindelijke concentratie van ~20 mg ml-1 voor de experimenten geïllustreerd in respectievelijk de figuren 4A en 4B. Het volume van het eiwitmonster in beide experimenten was ongeveer 0,3 μL en het MWCO van het RC-dialysemembraan dat in de microchips is ingebed, ligt in het bereik van 6-8 kDa. De lysozymkristallen in figuur 3A groeiden binnen 1 uur en de kristallen in figuur 3B groeiden binnen 30 minuten na het begin van het experiment. De kristallisatie-experimenten werden uitgevoerd onder statische omstandigheden. Er is echteraangetoond 19 dat het uitvoeren van de experimenten onder vloeiende omstandigheden de mogelijkheid biedt om de kristallisatieomstandigheden en studiefasediagrammen dynamisch uit te wisselen, waarbij de omkeerbaarheid van de microdialysemethode wordt geverifieerd. Ter plaatse Röntgendiffractiegegevens van de lysozymekristallen in figuur 4A werden verzameld om de geschiktheid van de dialysechips voor dergelijke experimenten aan te tonen. De gegevensverzameling werd uitgevoerd bij BM30A-FIP beamline (ESRF) bij kamertemperatuur, zoals beschreven in stap 7.2.1 van het protocol. De microchips werden aan de balklijn gemonteerd met behulp van de 3D-geprinte steun (figuur 3B) en complete röntgendiffractiegegevenssets werden verzameld uit twee enkelvoudige lysozymekristallen die onder de in tabel 1vermelde voorwaarden op de chip werden gekweekt . De waargenomen reflecties van de datasets werden verwerkt, geïndexeerd en geïntegreerd met behulp van XDS48 en de moleculaire vervanging en verfijning werden bereikt met respectievelijk Phaser49 en Phenix52. De kristallografische statistieken voor de volledige dataset van elk lysozymkristal en voor de samenvoeging van de twee datasets zijn opgenomen in tabel 2. Voor de moleculaire vervanging werd de PDB-ingang 193L gebruikt. Elektronendichtheidskaarten van één enkel lysozymkristal en de samengevoegde gegevensverzameling van de twee kristallen zijn verkregen op respectievelijk 1,95 Å en 1,85 Å en zijn geïllustreerd in de figuren 5A en 5B. Beide elektronendichtheidskaarten tonen gedetailleerde structurele informatie die kan worden verkregen door in situ röntgendiffractie-experimenten die rechtstreeks op de dialysemicrochip bij kamertemperatuur worden uitgevoerd vanuit een enkel kristal of uit meerdere kristallen, waardoor de chips compatibel zijn voor in situ röntgenkristallografiestudies. Figuur 1: Schematische illustratie van de dialysechip fabricage. (A) SU-8 hars wordt afgezet op twee siliciumwafels en gecoat gedraaid. (B) Een SU-8 master wordt verworven na bestraling van de fotoresist met UV-licht door middel van een fotomasker en het ontwikkelen van de onbelichte delen. (C) PDMS wordt toegediend aan de SU-8-meesters en na 1 uur uitgehard te zijn bij 338 K, (D) worden de 2 PDMS-mallen geproduceerd door replica-vorm- en inprenting van de micropatronen geschild van de meesters en (E) op de juiste grootte gesneden. (F) De PDMS-mallen worden ondersteund op een glazen glijbaan met het RC-dialysemembraan tussen de twee centrale pijlers. (G) De 2 PDMS-mallen worden vervolgens uitgelijnd en gedurende ~ 30 minuten uitgedroogd in een vacuümkamer. (H) De NOA 81 hars wordt tussen de twee mallen gegoten en (I) vult de ruimte door capillariteit. (J) Na de eerste blootstelling aan UV-licht wordt de onderste PDMS-mal verwijderd en wordt de assemblage op een PMMA-blad gedeponeerd. (K) De tweede UV-blootstelling volgt om de NOA 81-hars volledig te polymeriseren en de dialysechip is klaar voor gebruik na het verwijderen van de resterende bovenste PDMS-mal. (L) Zijaanzichtschema van de dialysechip waarbij alle lagen van het apparaat en hun respectieve dikte worden aangegeven. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Figuur 2: Dialysechips die een RC-dialysemembraan insluiten voor on-chip eiwitkristallisatie en in situ röntgendiffractie-experimenten. (A) NOA 81 microchips op 175 μm dik PMMA-substraat met een eiwitreservoir van 0,1 μL (links) en 0,3 μL (rechts) nominaal volume. (B) Microchips met pipetpunten als vloeistofconnectoren die op de in- en uitlaatpoorten van het vloeistofkanaal zijn gelijmd. (C) Afbeelding van een microchip tijdens een kristallisatie-experiment. Het eiwitmonster is ingekapseld met een stuk van 175 μm dik PMMA-blad en Kapton-tape. Peek Nanoport connectoren worden gebruikt voor de inlaat- en uitlaatpoorten van het vloeistofkanaal. (D) Bovenaanzicht van het eiwitreservoir tijdens de circulatie van de kristallisatieoplossing in het vloeistofkanaal. Lucht wordt opgesloten in het bovenste deel van het reservoir direct onder het RC-dialysemembraan, dat duidelijk kan worden gedetecteerd. (E) Bovenaanzicht van het dialysereservoir door een optische microscoop tijdens de afzetting van het eiwitmonster. De eiwitdruppel wordt vlak boven het ingebedde RC-dialysemembraan afgezet. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Figuur 3: De 3D-geprinte steun (A) voor de microchips die worden gebruikt tijdens kristallisatie-experimenten en (B) gemonteerd voor de röntgenstraal bij BM30A-FIP-straallijn bij de ESRF voor in situ röntgendiffractie-experimenten. (C) Achtergrondgeluid gegenereerd door de interactie van röntgenstralen met Kapton, RC-dialysemembraan, PMMA en de dialysechip (van links naar rechts). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Figuur 4: On-chip kristallisatie van lysozym met de microdialysemethode. (A) Lysozyme (~30 mg ml-1) kristallen geteeld op de chip onder 1,5 M NaCl en 0,1 M CH3COONa pH 4,0 en (B) lysozym (~20 mg ml-1) kristallen geteeld onder kristallisatieomstandigheden met 1 M NaCl, 0,1 M CH3COONa pH 4,5, en 30% PEG 400. Beide experimenten werden uitgevoerd op 293 K. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken. Figuur 5: Elektronendichtheidskaarten van de geraffineerde lysozymstructuur van (A) één kristal en (B) de samengevoegde dataset van twee kristallen die via microdialyse op de chip worden gekweekt. De kaarten werden verkregen op respectievelijk 1,95 Å en 1,84 Å, gevormd op 1σ. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Eiwit Eiwitconcentratie(mg ml-1) Eiwit bufffer Initiële concentratie vanprecipitant oplossing MWCO van RCdialysemembraan(kDa) TemperatuurK) Lysozyme ~ 30 Water 1,5 M NaCl0,1 M CH3COONa pH 4,0 6 – 8 293 Lysozyme ~ 20 jaar 20 mM CH3COONa pH 4,2 1 M NaCl0,1 M CH3COONa pH 4,530% PEG 400 6 – 8 293 Tabel 1: Samenstelling van de eiwitbuffer en de neerslagoplossing voor on-chip kristallisatie van lysozym met de microdialysemethode. De lysozymekristallen die on-chip werden gekweekt met de voorwaarden in de tweede lijn, werden gebruikt voor het verzamelen van röntgendiffractiegegevens in situ. Eiwit Lysozyme Lysozyme Lysozyme Aantal kristallen 1 1 2 Aantal diffractieframes 40 30 70 Oscillatie (°) per blootstelling 1 1 Belichtingstijd(en) 30 30 Temperatuur (K) 293 293 293 Ruimtegroep P43212 P43212 P43212 Celparameters van de eenheid 78.86 78.86 37.8790.0 90.0 90.0 79.17 79.17 37.9590.0 90.0 90.0 78.47 78.47 37.6590.0 90.0 90.0 Resolutiebereik (Å) 27.31 – 1.95(2.02 – 1.95) 27.39 – 1.96(2.03 – 1.96) 27.17 – 1.85(1.91 – 1.85) Mozaïek (°) 0.319 0.121 Totale reflecties (waargenomen) 25127 (3552) 19991 (3001) Unieke reflecties (waargenomen) 8641 (1357) 8295 (1321) 10404 (975) Redudancy 2.90 (2.61) 2.41 (2.27) Volledigheid (%) 95.0 (94.8) 91.9 (93.3) 98.23 (93.15) Gemiddelde ik/σ 6.83 (1.16) 7.09 (1.66) 3.7 CC(1/2) 99.1 (42.4) 97.9 (37.0) 97.0 R-samenvoegen 0.184 R-meas 0.139 0.221 0.219 R-pim 0.116 Reflecties die worden gebruikt bij verfijning 8645 (787) 8451 (857) 10391 (965) Reflecties gebruikt voor R-vrij 864 (78) 846 (85) 1039 (96) R-werk 0.1988 (0.2968) 0.1853 (0.2872) 0.1839 (0.3102) R-vrij 0.2430 (0.3437) 0.2297 (0.3622) 0.2207 (0.3703) Aantal niet-waterstofatomen 1069 1071 1096 Macromoleculen 1012 1012 1012 Water 55 57 82 Ligand 2 2 2 Eiwitresten 131 131 131 Rms (obligaties, Å) 0.008 0.009 0.005 Rms (hoeken, °) 1.17 1.26 1.05 Ramachandran favoriet (%) 98.43 97.64 99.21 Ramachandran toegestaan (%) 1.57 2.36 0.79 Ramachandran uitschieters (%) 0.00 0.00 0.00 Avegare B-factor 34.26 28.54 24.34 Eiwit 33.94 28.14 23.62 Water 40.23 35.57 33.16 Liganden 33.23 29.63 24.77 Tabel 2: Parameters voor gegevensverzameling, kristallografische en verfijningsstatistieken van lysozymekristallen die op de chip worden geteeld via de microdialysemethode. Waarden tussen haakjes komen overeen met de shell met de hoogste resolutie. De vierde kolom komt overeen met waarden die zijn verkregen na het samenvoegen van de gegevenssets van de tweede en derde kolom.

Discussion

Er is een microfluïdisch apparaat ontwikkeld voor on-chip eiwitkristallisatie met de microdialysemethode en in situ röntgendiffractie-experimenten bij kamertemperatuur. NOA 81-chips die RC-dialysemembranen van elke MWCO integreren om microdialyse te gebruiken voor on-chip eiwitkristallisatie, kunnen worden vervaardigd. Fabricagematerialen met een relatief hoge röntgentransparantie werden gebruikt, waardoor de chips compatibel werden voor in situ eiwitkristallografie. De fabricagematerialen die het compartiment samenstellen voor eiwitkristallisatie van het apparaat (PMMA, Kapton, RC dialysemembraan) werden geëvalueerd om weinig achtergrondgeluid te genereren. Met name het achtergrondgeluid dat door de dialysechip wordt gegenereerd, wordt voornamelijk waargenomen bij een lage resolutie (> 6 Å) en heeft geen invloed op de behandeling van diffractiegegevens met hoge resolutie van de grote lysozymekristallen die nodig zijn voor de bepaling van de eiwitstructuur. De automatisering van de gegevensverzameling wordt versterkt met behulp van een 3D-geprinte ondersteuning die direct in macromoleculaire kristallografiestraallijnen kan worden gemonteerd en tot drie microchips tegelijkertijd kan dragen. Op deze manier wordt handmatig oogsten en manipuleren van de fragiele eiwitkristallen vermeden. Bovendien vindt de gegevensverzameling plaats bij kamertemperatuur, waarbij de noodzaak van cryoprotectie wordt vermeden die verband kan houden met conformatieveranderingen van de inheemse eiwitstructuur²^,³.

Het gebruik van microdialyse als methode om kristallen on-chip te laten groeien, maakt het mogelijk om het kristallisatieproces nauwkeurig te monitoren en te controleren. Zoals besproken in de inleiding, zijn de meeste conventionele eiwitkristallisatiemethoden geïmplementeerd met behulp van microfluïdische apparaten¹¹^,¹⁴. De voordelen van dialyse voor eiwitkristallisatie waren echter nog niet volledig benut op microschaal. On-chip microdialyse biedt de mogelijkheid om fasediagrammen te bestuderen en screening en optimalisatie van kristallisatieomstandigheden uit te voeren met hetzelfde eiwitmonster¹⁹. Voor de prototypes die in dit werk worden gepresenteerd, is het eiwitverbruik per chip beperkt tot 0,1 of 0,3 μL. Op basis van het experimentele werk tot nu toe zijn de meest kritieke stappen van het protocol niet afkomstig van de fabricageprocedure van de chips, maar van het kristallisatieproces. Het fabricageprotocol bevat veel stappen, maar het is eenvoudig en maakt de fabricage van tal van apparaten (20 tot 30 chips) op één dag in de cleanroom mogelijk, met relatief goedkope materialen. De on-chip kristallisatie van eiwitten kan echter een delicate procedure zijn vanwege de intrinsieke stochastische aard van nucleatie en kristalgroei, vooral in de microschaal. Er is een case study beschreven, waarbij gevestigde omstandigheden werden gebruikt voor de kristallisatie van lysozym die robuuste, goed gedefinieerde kristallen opleverde die geschikt waren voor het verzamelen van röntgendiffractiegegevens in situ. Niettemin kunnen er problemen ontstaan door het gebruik van uitdagendere eiwitdoelen, zoals membraaneiwitten, waarbij het kristallisatiemedium veel ingewikkelder is, fasediagrammen niet bekend zijn en de goed werkende kristallisatieomstandigheden nog niet goed zijn vastgesteld. De dialysechip biedt de mogelijkheid om deze moeilijkheden te overtreffen en fasediagrammen op de chip te bestuderen, zonder het waardevolle en vaak kostbare eiwitmonster te verwijderen, door alleen de kristallisatieoplossing in het microfluïdische kanaal uit te wisselen.

De veelzijdigheid van de microfluïdische apparaten komt voort uit het gebruik van microdialyse voor on-chip eiwitkristallisatie om kristallisatieomstandigheden omkeerbaar te regelen en concentratie- en temperatuurvariatiefasediagrammen in kaart te brengen met een laag eiwitvolume. Bovendien is het apparaat compatibel met in situ röntgendiffractie-experimenten en is de prototyping van de apparaten goedkoop en snel. Talrijke, isomorfe kristallen van oplosbare en membraaneiwitten (in voorbereiding) kunnen on-chip worden gekweekt en de verwachting is dat al deze kenmerken kunnen worden gebruikt voor seriële röntgenkristallografiestudies van uitdagende eiwitdoelen in synchrotron- en XFEL-faciliteiten. Ten slotte is het uitvoeren van on-chip en in situ time-resolved studies een toekomstige mogelijkheid die van aanzienlijk belang kan zijn voor de kristallografische gemeenschap. Daarom zullen toekomstige inspanningen, door kristallen op de dialysechip te kweken en de reagentia in het microfluïdische kanaal te introduceren, hetzij handmatig (met behulp van een spuit) of automatisch (met een drukregelvloeistofsysteem of een spuitpomp), zich richten op het bewijzen dat de microfluïdische chips met succes kunnen worden gebruikt om tijdgeopgeleerde experimenten op synchrotronstraallijnen te activeren.

Açıklamalar

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

MBS erkent de steun van de MI / CNRS in het kader van het contract Instrumentation at the limits 2014-2015. NJ erkent CEA’s International Doctoral Research Program (Irtelis) voor de PhD Fellowship. MBS en SJ erkennen de financiering uit het Horizon 2020-onderzoeks- en innovatieprogramma van de Europese Unie in het kader van marie Skłodowska-Curie-subsidieovereenkomst nummer 722687. MBS, SJ en NJ bedanken LIPhy (UGA) voor de cleanroom vestiging voor microfabrication experimenten. IBS erkent integratie in het Interdisciplinair Onderzoeksinstituut van Grenoble (IRIG, CEA).

Materials

3 in wafer	Silicon Materials Inc.		Silicon wafer
Centrifuge	Eppendorf	Minispin	Bench-top centrifuge
CleWin 3.0	WieWeb software		Designing software
Epoxy glue	Devcon		5 minutes epoxy glue
Fluidic connectors	Cluzeau Info Lab	N-333	NanoPort kit for 1/16" OD tubing
Hen egg-white lysozyme	Roche	10 837 059 001	Lyophilized protein powder
High-vacuum silicone grease	Sigma-Aldrich	Z273554	Dow Corning high-vacuum silicone grease
HMDS	Sigma-Aldrich	440191	Silane, chemical
Hot plate	Sawatec	HP-200-Z-HMDS BM	Hot plate
Isopropyl alcohol	Sigma-Aldrich		Solvent
Kapton tape	DuPont		Polyimide tape
Mask aligner	SUSS MicroTec	MJB4	Mask aligner, UV source
Membrane filter	Millipore	GSWP04700	0.22 μm pore size filter
Microscope glass slide	Fisher Scientific	12164682	3 x 1 in glass slides
NOA81	Norland Products Inc.	NOA81	Photocurable resin
Oven	Memmert		Oven
Parafilm	Sigma-Aldrich	P6543	Parafilm M roll size 20 in. × 50 ft
PDMS	Dow Corning	Sylgard 184	Silicone
PEG 400	Hampton Research	HR2-603	Chemical
Petri dish	Sigma-Aldrich	P5731	100 x 15 mm
PGMEA	Sigma-Aldrich	484431	Developer
Plasma equipment	Diener Electronic	ZEPTO	Plasma treatment
PMMA	Goodfellow	137-745-63	PMMA sheets 150×150 mm, 0.175 mm thickness
Pressure driven system	Elveflow	OB1 MK3+	Pressure/vacuum controller
PTFE tubing	Elveflow/Darwin microfluidics	LVF-KTU-15	PTFE tubing roll 1/16" OD X 1/32" ID
RC dialysis membrane	Spectra/Por		Various MWCOs
Scalpel	Swann-Morton		Carbon steel surgical blades
Sodium acetate	Sigma-Aldrich	S2889	Chemical
Sodium chloride	Sigma-Aldrich	746398	Chemical
Solidworks	Dassault Systemes		3D-CAD designing software
Spin coater	SPS	Spin150	Wafer spinner
SU-8 3000 series	MicroChem Corp.	SU-8 3050	Photoresist
Syringe	BD	309628	1 mL Luer-Lok syringe
UV crosslinker	Uvitec	CL-508	UV crosslinker

Referanslar

Garman, E. F. Radiation damage in macromolecular crystallography: what is it and why should we care. Acta Crystallographica, Section D: Biological Crystallography. 66, 339-351 (2010).
Henderson, R. The potential and limitations of neutrons, electrons and X-rays for atomic resolution microscopy of unstained biological molecules. Quarterly Reviews of Biophysics. 28 (2), 171-193 (1995).
Fraser, J. S., et al. Accessing protein conformational ensembles using room-temperature X-ray crystallography. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (39), 16247-16252 (2011).
Gotthard, G., et al. Specific radiation damage is a lesser concern at room temperature. IUCrJ. 6 (4), 665-680 (2019).
Martin-Garcia, J. M., Conrad, C. E., Coe, J., Roy-Chowdhury, S., Fromme, P. Serial femtosecond crystallography: A revolution in structural biology. Archives of Biochemistry and Biophysics. 602, 32-47 (2016).
Gicquel, Y., et al. Microfluidic chips for in situ crystal X-ray diffraction and in situ dynamic light scattering for serial crystallography. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (134), e57133 (2018).
Chapman, H. N., et al. Femtosecond X-ray protein nanocrystallography. Nature. 470, 73-78 (2011).
Hunter, M. S., et al. Fixed-target protein serial microcrystallography with an x-ray free electron laser. Science Reports. 4, 6026 (2014).
Pawate, A. S., et al. Towards time-resolved serial crystallography in a microfluidic device. Acta Crystallographica, Section F: Structural Biology Communications. 71, 823-830 (2015).
Owen, R. L., et al. Low-dose fixed-target serial synchrotron crystallography. Acta Crystallographica, Section D: Structural Biology. 73, 373-378 (2017).
Leng, J., Salmon, J. -. B. Microfluidic crystallization. Lab on a Chip. 9, 24-34 (2009).
Morel, M., Galas, J. -. C., Dahan, M., Studer, V. Concentration landscape generators for shear free dynamic chemical stimulation. Lab on a Chip. 12, 1340-1346 (2012).
Miralles, V., Huerre, A., Malloggi, F., Jullien, M. -. C. A review of heating and temperature control in microfluidic systems: techniques and applications. Diagnostics. 3, 33-67 (2013).
Sui, S., Perry, S. L. Microfluidics: from crystallization to serial time-resolved crystallography. Structural Dynamics. 4, 032202 (2017).
Hansen, C. L., Sommer, M. O. A., Quake, S. R. Systematic investigation of protein phase behavior with a microfluidic formulator. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (40), 14431-14436 (2004).
Laval, P., Lisai, N., Salmon, J. -. B., Joanicot, M. A microfluidic device based on droplet storage for screening solubility diagrams. Lab on a Chip. 7, 829-834 (2007).
Shim, J. -. U., et al. Control and measurement of the phase behavior of aqueous solutions using microfluidics. Journal of the American Chemical Society. 129, 8825-8835 (2007).
Selimovic, S., Gobeaux, F., Fraden, S. Mapping and manipulating temperature-concentration phase diagrams using microfluidics. Lab on a Chip. 10, 1696-1699 (2010).
Junius, N., et al. A microfluidic device for both on-chip dialysis protein crystallization and in situ X-ray diffraction. Lab on a Chip. 20, 296-310 (2020).
Greaves, E. D., Manz, A. Towards on-chip X-ray analysis. Lab on a Chip. 5, 382-391 (2005).
Dhouib, K., et al. Microfluidic chips for the crystallization of biomacromolecules by counter-diffusion and on-chip crystal X-ray analysis. Lab on a Chip. 9, 1412-1421 (2009).
Guha, S., Perry, S. L., Pawate, A. S., Kenis, P. J. A. Fabrication of X-ray compatible microfluidic platforms for protein crystallization. Sensors and Actuators B. Chemical. 174, 1-9 (2012).
Sui, S., et al. Graphene-based microfluidics for serial crystallography. Lab on a Chip. 16, 3082-3096 (2016).
Russo Krauss, I., Merlino, A., Vergara, A., Sica, F. An overview of biological macromolecule crystallization. International Journal of Molecular Science. 14, 11643-11691 (2013).
McPherson, A., Gavira, J. A. Introduction to protein crystallization. Acta Crystallographica, Section F: Structural Biology and Crystallization Communications. 70, 2-20 (2014).
Zheng, B., Tice, J. D., Roach, L. S., Ismagilov, R. F. A droplet-based, composite PDMS/Glass capillary microfluidic system for evaluating protein crystallization conditions by microbatch and vapor-diffusion methods with on-chip X-ray diffraction. Angewandte Chemie. 43, 2508-2511 (2004).
Talreja, S., Kim, D. Y., Mirarefi, A. Y., Zukoski, C. F., Kenis, P. J. A. Screening and optimization of protein crystallization conditions through gradual evaporation using anovel crystallization platform. Journal of Applied Crystallography. 38, 988-995 (2005).
Hansen, C. L., Classen, S., Berger, J. M., Quake, S. R. A microfluidic device for kinetic optimization of protein crystallization and in situ structure determination. Journal of American Chemical Society. 128, 3142-3143 (2006).
Schieferstein, J. M., et al. X-ray Transparent microfluidic platforms for membrane protein crystallization with microseeds. Lab on a Chip. 18, 944-954 (2018).
Ghazal, A., et al. Recent advances in X-ray compatible microfluidics for applications in soft materials and life sciences. Lab on a Chip. 16, 4263-4295 (2016).
Li, L., Ismagilov, R. F. Protein crystallization using microfluidic technologies based on valves, droplets, and SlipChip. Annual Review of Biophysics. 39, 139-158 (2010).
Du, W., Li, L., Nichols, K. P., Ismagilov, R. F. SlipChip. Lab on a Chip. 9, 2286-2292 (2009).
Zhang, S., et al. Microfluidic platform for optimization of crystallization conditions. Journal of Crystal Growth. 472, 18-28 (2017).
Abdallah, B. G., et al. Protein crystallization in an actuated microfluidic nanowell device. Crystal Growth & Design. 16, 2074-2082 (2016).
Monteiro, D. C. F., et al. A microfluidic flow-focusing device for low sample consumption serial synchrotron crystallography experiments in liquid flow. Journal of Synchrotron Radiation. 26, 406-412 (2019).
de Wijn, R., et al. A simple and versatile microfluidic device for efficient biomacromolecule crystallization and structural analysis by serial crystallography. IUCrJ. 6, 454-464 (2019).
Shim, J. -. U., Cristobal, G., Link, D. R., Thorsen, T., Fraden, S. Using microfluidics to decouple nucleation and growth of protein crystals. Crystal Growth & Design. 7, 2192-2194 (2007).
de Jong, J., Lammertink, R. G. H., Wessling, M. Membranes and microfluidics: a review. Lab on a Chip. 6, 1125-1139 (2006).
Paustian, J. S., Nery Azevedo, R., Lundin, S. T. B., Gilkey, M. J., Squires, T. M. Microfluidic microdialysis: spatiotemporal control over solution microenvironments using integrated hydrogel membrane microwindows. Physical Review X. 3, 041010 (2013).
Kornreich, M., Heymann, M., Fraden, S., Beck, R. Cross polarization compatible dialysis chip. Lab on a Chip. 14, 3700-3704 (2014).
Song, S., Singh, A. K., Shepodd, T. J., Kirby, B. J. Microchip dialysis of proteins using in situ photopatterned nanoporous polymer membranes. Analytical Chemistry. 76, 2367-2373 (2004).
Skou, M., Skou, S., Jensen, T. G., Vestergaard, B., Gillilan, R. E. In situ microfluidic dialysis for biological small-angle X-ray scattering. Journal of Applied Crystallography. 47, 1355-1366 (2014).
Zou, L., et al. A multistage dialysis microdevice for extraction of cryoprotectants. Biomedical Microdevices. 19, 30 (2017).
Satya Eswari, J., Naik, S. A critical analysis on various technologies and functionalized materials for manufacturing dialysis membranes. Materials Science for Energy Technologies. 3, 116-126 (2020).
Spano, M., Salmon, J. -. B., Junius, N. FR3044685A1. UJF. , (2015).
Bartolo, D., Degre, G., Nghe, P., Studer, V. Microfluidic stickers. Lab on a Chip. 8, 274-279 (2008).
Junius, N., et al. A crystallization apparatus for temperature controlled flow-cell dialysis with real-time visualization. Journal of Applied Crystallography. 49, 806-813 (2016).
Kabsch, W. XDS. Acta Crystallographica, Section D: Biological Crystallography. 66, 125-132 (2010).
Winn, M. D., et al. Overview of the CCP4 suite and current developments. Acta Crystallographica, Section D: Biological Crystallography. 67, 235-242 (2011).
Emsley, P., Lohkamp, B., Scott, W. G., Cowtan, K. Features and developments of COOT. Acta Crystallographica, Section D: Biological Crystallography. 66, 486-501 (2010).
Apostolopoulou, V., Junius, N., Sear, R. P., Budayova-Spano, M. Mixing salts and polyethylene glycol into protein solutions: The effects of diffusion across semipermeable membranes and of convection. Crystal Growth & Design. 20, 3927-3936 (2020).
Liebschner, D., et al. Macromolecular structure determination using X-rays, neutrons and electrons: recent developments in Phenix. Acta Crystallographica, Section D: Structural Biology. 75, 861-877 (2019).
Xia, Y., Whitesides, G. M. Soft Lithography. Annual Review of Materials Science. 28, 153-184 (1998).
Nogly, P., et al. Lipidic cubic phase injector is a viable crystal delivery system for time-resolved serial crystallography. Nature Communications. 7, 12314 (2016).
Baxter, E. L., et al. High-density grids for efficient data collection from multiple crystals. Acta Crystallographica, Section D: Structural Biology. 72, 2-11 (2016).
Feiler, C. G., Wallacher, D., Weiss, M. S. An all-in-one sample holder for macromolecular X-ray crystallography with minimal background scattering. Journal of Visualized Experiments. (149), e59722 (2019).

Etiketler

Protein Crystallization Microfluidic Chips Dialysis In Situ X-ray Diffraction PDMS SU8 Master Regenerated Cellulose Dialysis Membrane Protein Sample Volume Crystallization Conditions Nucleation Crystal Growth Phase Diagrams

Play Video

PDF

DOI

DOWNLOAD MATERIALS LIST

Bu Makaleden Alıntı Yapın

Jaho, S., Junius, N., Borel, F., Sallaz-Damaz, Y., Salmon, J., Budayova-Spano, M. Crystallization of Proteins on Chip by Microdialysis for In Situ X-ray Diffraction Studies. J. Vis. Exp. (170), e61660, doi:10.3791/61660 (2021).