Burada bitkilerdeki inositol polifosfatları tespit etmek ve ölçmek için son derece hassas bir yöntem olan[3H]-myo-inositol etiketli fidelerin güçlü aniyon değişimi yüksek performanslı sıvı kromatografisini tanımlıyoruz.
Inositol fosfat (InsPs) olarak da adverilen miyo-inositolün fosfat esterleri, bitki fizyolojisinde önemli rol oynayan hücresel regülatörler sınıfıdır. Negatif yük, düşük bolluk ve hidrolitik aktivitelere yatkınlık nedeniyle bu moleküllerin saptanması ve ölçülmesi zordur. Bu durum özellikle inositol pirofosfat (PP-InsPs) olarak da adlandırılan ‘yüksek enerjili’ diphospho bağları içeren yüksek fosforlu formlar için geçerlidir. Yüksek hassasiyeti nedeniyle,[3H]-myo-inositol ile etiketlenmiş bitkilerin güçlü aiyon değişimi yüksek performanslı sıvı kromatografisi (SAX-HPLC) şu anda bu molekülleri analiz etmek için tercih edilen yöntemdir. [33H]-myo-inositol ile radiolabel bitki fideleri kullanılarak, çeşitli antiomerik izomerler de dahil olmak üzere çeşitli InsP türleri tespit edilebilir ve yüksek hassasiyetle ayırt edilebilir. Burada, uygun bir SAX-HPLC sisteminin kurulumu, yanı sıra bitki ekimi, radyolabeling ve SAX-HPLC çalıştırmak ve sonraki veri analizi için InsP çıkarma tam iş akışı açıklanmıştır. Burada sunulan protokol, çeşitli insp türlerinin, çeşitli antimekomerik izomerler ve PP-InsPs, InsP7 ve InsP8dahil olmak üzere ayrımcılığına ve nicelemesine olanak sağlar ve diğer bitki türlerine kolayca adapte edilebilir. Örnek olarak Arabidopsis thaliana ve Lotus japonicus fidelerinin SAX-HPLC analizleri yapılmalı ve tam InsP profilleri sunulmuş ve tartışılmıştır. Burada açıklanan yöntem, Bitkilerdeki InsP’lerin biyolojik rollerini daha iyi anlamak için umut verici bir aracı temsil etmektedir.
Neredeyse kırk yıl önce, inositol fosfatlar (InsPs) sinyal molekülleri olarak ortaya çıktı, Ins sonra (1,4,5)P3 (InsP3) hayvan hücrelerinde Ca2 reseptör aracılı salınımını aktive ikinci bir haberci olarak tespit edildi1,2. Bugüne kadar, hiçbir InsP3 reseptörü (IP3-R) bitkilerde tespit edilmiştir, hangi bitki hücrelerinde InsP3 için doğrudan bir sinyal rolü sorular3. Ne olursa olsun, InsP,3 ,belirli sinyal yolları3,4,5,,6,,7,8düzenlenmesi de dahil olmak üzere, çeşitli bitki gelişim süreçlerinde yer alan diğer InsPs için bir öncü olarak hizmet vermektedir. Örneğin, InsP3 daha fazla insP6fosforile edilebilir , ayrıca fosfat önemli bir kaynağı temsil eden “fitik asit”, myo-inositol ve katyonlar, ve patojenlere karşı bitki savunma önemli rol oynadığı gösterilmiştir, mRNA ihracat ve fosfat homeostasis5,9,10,11,12.
Inositol pirofosfatlar (PP-InsPs) en az bir yüksek enerjili di-fosfo bağı içeren insps bir sınıftır, başlangıçta hayvan hücrelerinde tanımlanan, amip ve maya, onlar çeşitli hücresel süreçlerde kritik rol oynamaknerede 13,14,15. Bitkilerde PP-InsPs üzerinde ufuk açıcı çalışmalara rağmen16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26, bu moleküllerin biyolojik fonksiyonları ve izomer kimliği hala büyük ölçüde esrarengiz kalır. Model bitki Arabidopsis thaliana, hücresel InsP8 insPtesadüf-algılama yoluyla böcek otobur ve nekrotrofik mantarlara karşı savunma düzenlemek için önerilmiştir 8 ve ASK1-COI1-JAZ reseptör kompleksi tarafından aktif jasmonate17. Ayrıca, Enerji homeostaz ve besin algılama in InsProlleri 8 ve diğer PP-InsPs, yanı sıra fosfat homeostazönerilmiştir 17,23,24,25,26.
Kullanılan biyolojik sistem ne olursa olsun, InsPs çalışırken önemli bir metodolojik sorun bu moleküllerin güvenilir tespiti ve hassas nicelleştirilmesi olmuştur. Hücre ekstrelerinden PP-InsPs dahil insp’leri tespit etmek için kütle spektrometresi tabanlı yöntemler kullanılmıştır. Ancak, bu çalışmalar farklı izomerleri ayırt etmek için başarısızoldu 26,27. InsPs’i analiz etmek için başka bir yaklaşım, TiO2 boncuklarını kullanarak hücre lizatlarından InsP’lerin çekilmesini, ardından eluted InsPs’in poliakrilamid jel elektroforezini (PAGE) kullanır. InsPs sonra ya toluidin mavi veya DAPI24,,28,,29tarafından boyanmış olabilir. Ancak, bu yöntemi kullanarak bitki özlerinden InsP5’ten daha düşük InsPs’leri güvenilir bir şekilde tespit etmek mümkün değildir. Son zamanlarda, insps nükleer manyetik rezonans (NMR) analizi için [13C]-myo-inositol kullanarak bir yöntem güçlü aniyon değişimi yüksek performanslı sıvı kromatografisi (SAX-HPLC)30alternatif olarak yayınlandı. Bu teknik SAX-HPLC ile karşılaştırıldığında benzer bir duyarlılık elde etmek ve 5-InsP7tespiti sağlamak için bildirilmiştir , hücre özlerinden farklı antimekomerik InsP5 izomerleri ayrımcılık. Ancak, NMR tabanlı yöntemin uygulanması kimyasal olarak sentezlenmiş ve ticari olarak mevcut değildir [13C]-myo-inositol gerektirir. Bu nedenle, çoğu durumda kullanılan yöntem [3H]-myo-inositol, SAX-HPLC31,32,33takip ile örnekleri radyoetiketleme olduğunu.33 Bu teknik, bitkiiçine radyoaktif miyo-inositol alımı ve özel hücresel kinaz ve fosfatazların kombine aktivitesi ile farklı InsPs içine dönüşüm dayanmaktadır.
[33H] etiketli InsPs sonra asit ayıklanır ve SAX-HPLC kullanılarak fraksiyona alınır. Negatif yüklerinden dolayı, InsPs’ler SAX-HPLC sütununun pozitif yüklü sabit fazı ile güçlü bir şekilde etkileşime girerek, kolondaki InsPs’leri aşacak şekilde artan fosfat konsantrasyonları içeren bir tampon degrade ile eluted olabilir. Böylece elüsyon süreleri ayrılacak Olan InsP türünün yük ve geometrisine bağlıdır. Chiral sütunların yokluğunda, sadece non-enantiomerik izomerler bu protokol ile ayrılmış olabilir. Ancak, radiolabeled standartları belirli bir InsP tepe izomrik doğasını atamak için kullanılabilir. Geçmişte çeşitli laboratuvarlar tarafından (biyo)kimyasal yöntemlerle etiketlenmiş ve etiketlenmemiş standartlar oluşturmak veya onları çeşitli hücre ve organizmalardan arındırmak için yapılan birden fazla çaba, belirli InsP türlerine zirveler atamaya yardımcı oldu ve ayrıca bireysel InsPtürlerinin5,7,21,34,,35,36,37,38,39,40,41,42,43. Ayrıca, bitkilerde PP-InsPs oluşumuna yol açan enzimatik yolların son açıklaması, hem de belirli bir 1-phytase aktivitesi ile bir bakteriyel tip III efektör keşfi, bu analizler için yararlı standartlar oluşturmak için nasıl bilgi sağlamak10,17,18,22,23.
Ortaya çıkan kesirler, trityumun(3H) β çürümesi nedeniyle sıvı bir sintilasyon sayacında ölçülebilir. Artan etiketleme süresi ile, sabit durum izotopik denge ulaşılır, sonra elde edilen InsP profilleri bitkinin InsP durumunu temsil etmelidir31. Bu protokolün diğer mevcut tekniklere kıyasla en büyük avantajı, InsP’lerin doğrudan öncülünün kullanılması ve radyoaktif sinyalin ölçülmesi ile elde edilen yüksek hassasiyettir.
[3H]-myo-inositol etiketli bitkilerden veya diğer organizmalardan elde edilen örneklerin SAX-HPLC’si, insp’lerin metabolizmasını, işlevini ve eylem modlarını daha iyi anlamak için değerli bir aracı temsil eden, alt InsP türlerinden PP-InsP’lere kadar insp’lerin saptanması ve ölçülmesi için yaygın olarak kullanılır. Şimdiye kadar, bu yöntem aynı zamanda düşük InsP türlerine özel ilgi ile araştırmacılar için en uygun seçimdir. Bu prosedürün temelleri, hangi protokol burada inşa, daha önceaçıklanan 7,21,31,34, bitki kaynaklı InsPs analizi için özel ayrıntılı bir protokol ve özellikle PP-InsPs hala eksik. Önceki yayınlar, düşük bol PP-InsP’leri güvenilir bir şekilde tespit etmede güçlükler rapor özellikle InsP8, aşağıdaki faktörlerden biri veya daha fazlası nedeniyle: nispeten düşük miktarda bitki materyali, [3H]- düşük spesifik aktivite (> 20 Ci/mmol) ilemyo-inositol), perklorik asit temel olmayan veya 1 M’den daha az konsantre olan ekstraksiyon tamponlarının kullanımı, farklı nötralize tamponlar, ayrıca [3 H] alt-optimal gradyan veya algılama[3H] bir-line dedektörü ile. Bu çalışmalara göre, burada sunulan protokol PP-InsPs7,21,,34güvenilir tespiti için tasarlanmıştır.
Burada, ekipmanın tesis ekimi ve etiketleme, InsP ekstraksiyonu ve SAX-HPLC’nin kendi kendine çalışmasına kadar ayrıntılı bir iş akışı salıyoruz. Yöntem model bitki A. thalianaoptimize edilmiş olmasına rağmen , kolayca diğer bitki türlerini incelemek için değiştirilebilir, burada model baklagil Lotus japonicusilk bildirilen InsP profili ile gösterildiği gibi . Farklı bir bitki türünün kullanımı bazı optimizasyon gerektirebilir rağmen, bu küçük olacağını öngörüyoruz, bu protokol bitki InsPs daha fazla araştırma için iyi bir başlangıç noktası yapma. Olası optimizasyonları kolaylaştırmak için, protokolün içinde değişikliklerin mümkün olduğu her adımı ve yöntemi ilk kez oluştururken zor olabilecek tüm kritik adımları belirtiriz. Ayrıca, bu yöntemle elde edilen verilerin belirli InsP’lerin nicelleştirilmesi nde nasıl kullanılabileceğini ve farklı örneklerin nasıl analiz edilip karşılaştırılabildiğini de rapor ediyoruz.
Burada bitki özlerinde PP-InsPs dahil InsPs ölçmek ve bu yöntemin nasıl kurulabilir pratik ipuçları sağlamak için çok yönlü ve hassas bir yöntem salıyoruz. Protokol genellikle sağlam olsa da, suboptimal çalışır ve analizler oluşabilir. Çoğu durumda, bu çalışır güçlü bir azalma ya da yüksek fosforiile InsPs, özellikle PP-InsP türleri InsP7 ve InsP8tam kaybı ile tespit edilebilir. Olası nedenler, bitki materyalinin mikrobiyal kontaminasyonları ve endojen bitki PP-InsP hidrolazlarının yetersiz öğütme ve ekme tamponu ile hemen temas etmeyecek bitki materyalinin erimesi nedeniyle ekstraksiyon sırasında yetersiz deaktivasyonu olabilir. Diğer nedenler arasında nötralizasyon arabelleği yetersiz veya aşırı ilave sayılarak yanlış pH ayarı veya sadece yetersiz numune materyali sayılabilir. Bu genellikle hücrelerde çok düşük miktarlarda mevcut olduğundan ikincisi, PP-InsPs tespit etmek zor yapabilirsiniz. Adım 3.5 sırasında numune materyalinin fazlalığı veya verimsiz kuruma perklorik asitin seyreltilmesine neden olabilir, bu nedenle yetersiz enzim deaktivasyonuna ve insP6 ve PP-InsP’lerin özel kaybına da yol açabilir. Bu protokolde kullanılan tesis malzemesi ve radyoetiketi nin miktarı maliyet ve performansa göre optimize edilebilmiş ve bu nedenle en iyi sonuçları sağlamak için hala yeterli olan en düşük tutara yakındır. Buna ek olarak, sütun reçine yavaş yavaş çözünürlük kapasitesini kaybeder. Bu sürecin ilk işareti (yazarlar için tamamen açık olmayan nedenlerle) HPLC spektrumundaki PP-InsPs gibi yüksek fosforlu InsP türlerinin belirli bir kaybıdır. Daha fazla yaşlanma ile, hatta InsP6 sütun(Şekil 1D)tarafından düzgün çözülmüş olmayacaktır. Bu nedenle, yeterli bir sütunun kullanımının yanı sıra numunenin titizlikle taşınması ve HPLC bileşenlerinin doğru bakımı doğru sonuçların sağlanması için çok önemlidir.
Numuneleri ve çalıştırmaları karşılaştırırken, özellikle farklı ekipmanlarla (örneğin, HPLC sistemleri ve sütunları) veya farklı günlerde oluşturulduğunda, numunelerin birbirleriyle normalleştirilmesi (adım 7.3’te açıklandığı gibi) ve bunları aynı şekilde analiz etmek çok önemlidir. Sadece normalleştirme yoluyla aynı grafikte birden fazla örnek göstermek mümkündür (Şekil 3). Toplam InsPs’e veya başka bir InsP türüne göre tek tek InsPs’lerin sayısallaştırılması için, yalnızca göreli değerler ve mutlak değerler gösterilmedikçe normale dönmek gerekmez. İdeal olarak, hem InsP profilleri hem de nicelikselleştirmeler gösterilir. Ancak, bazı durumlarda aynı grafikte iki veya daha fazla çalıştırmayı yeterli şekilde göstermek mümkün değildir. Farklı saklama süreleri veya farklı arka plan aktivitesi düzeyleri, tek başına ölçülmemiş SAX-HPLC profillerini karşılaştırmayı zorlaştırabilir. Birçok örnek karşılaştırılmak gerektiğinde aynı doğrudur. Bu gibi durumlarda, bireysel tepe ölçme için ek bir yazılım (örneğin, Origin) kullanılarak daha fazla değerlendirme gereklidir.
Yazarlar burada açıklanan protokolün optimize edilebildiğini ve her bir araştırma sorusuna uyarlanması gerektiğinin farkındadırlar. Arabidopsis özleri için optimize edilmiş olmasına rağmen7,17 Bu protokolde, bu yöntem çok yönlüdür ve diğer bitki türlerinin InsP profillerinin belirlenmesine de yardımcı olabilir. Burada ilk kez l. japonicusiçin bir InsP profili sunarak bu olasılığı örneklemektedir , hangi etiketleme koşulları hiçbir değişiklik gerekli, InsP çıkarma veya SAX-HPLC çalıştırmak (Şekil 2). Özellikle, genel olarak benzer olmakla birlikte, L. japonicus ve Arabidopsis InsP profilleri arasında farklılıklar gözlenmektedir. Örneğin, L. japonicus InsP5 [4-OH] veya enantiomerik formu InsP5 [6-OH] daha fazla InsP5 [1-OH] veya enantiomerik formu InsP5 [3-OH] Arabidopsisgöre , nerede InsP5 [1-OH] veya enomerantiic formu InsP5 [3-OH] daha fazla dır Baskın InsP türleridir.5 Aynı şekilde, medya bileşimindeki değişikliklerin, [3H]- myo -inositolkonsantrasyonu,bitki yaşı, çevre koşulları (örneğin, ışık ve sıcaklık), kimyasal bileşiklerin eklenmesi veya diğer faktörler arasındaki bitki-mikrobiyal etkileşimlerin analizlerinin test edilmesi ve uyarlanabileceği öngörüyoruz.
Bu yöntemin dikkate alınması gereken önemli bir dezavantajı etiketleme çoğu kara bitkileri için fizyolojik bir ortam temsil etmez (steril) sıvı kültür, yapılır olmasıdır. Buna ek olarak, [³H]-myo-inositol yüksek maliyetler nedeniyle, etiketleme çözeltisi hacmi ve kültür kabının boyutu genellikle sınırlıdır, hangi da kullanılabilir bitkilerin boyutunu kısıtlar. Sıvı kültürde ekimi doğrudan örneğin toprakta yetiştirilen bitkilerin yaprakları [³H]-myo-inositol ve daha sonra burada açıklanan protokolü izleyerek sızma önlenebilir, daha önce bildirilen10.
Bu protokolün, TiO2 pull-down ve ardından PAGE veya kütle spektrometresi teknikleri gibi alternatif yöntemlerle karşılaştırıldığında çeşitli dezavantajları vardır. [3H]-myo-inositol etiketlemesi nedeniyle, sonunda sadece radyoetiketli myo-inositol’den kaynaklanan InsP türleri tespit edilir. Burada açıklanan yöntem scyllo-inositol ve diğer izomerleri bazı bitkilerde tespit edilmiştir gibi diğer Ins izomerleri kör44. Ayrıca, diğer yollardan elde edilen myo-InsPs, miyo-inositol ve myo-inositol-3-fosfat isomerizasyonu yoluyla miyo-6-fosfat, miyo-inositol-3-fosfat sintaz (MIPS) proteinleri45de novo sentezi ile sentezlenenler de dahil olmak üzere dışlanacaktır. [32P] veya[33P]-orto-fosfat alternatif etiket olarak kullanılabilse de, bunların kullanımı büyük bir dezavantaj teşkil eder, çünkü bol nükleotitler ve türevleri de dahil olmak üzere her fosfat içeren molekül etiketlenecektir. Bu moleküller de bu protokol ile ayıklanabilir ve SAX sütununa bağlanabilir, hangi bireysel InsP zirveleri belirlenmesi ile müdahale edecek arka plan aktivitesi yüksek düzeyde neden olacak5. Buna ek olarak,[32P]- veya [33P] -etiketli InsPs ve PP-InsPs’lerin sayısallaştırılması fosfat ve pirofosfat moiety cirosundan güçlü bir şekilde etkilenebilir ve inositol türleri için kitlesel bir okuma rapor olmayabilir.
Diğer taraftan, [3H]-myo-inositol özellikle myo-inositol içeren molekülleri etiketler. InsPs, inositol içeren lipidler, fosfoinositititler gibi, ve galactinol bu durumda etiketli. Ancak, lipidler ekstraksiyon tamponunda çözünmez olduğundan ve galactinol SAX sütununa bağlanmadığından, sadece InsPs bu protokol ile analiz edilecektir.
Şimdiye kadar, tio2 pulldown/PAGE tarafından belirlenen bir etiketle karşılaştırıldığında [3H]-myo-inositol etiketlemesi tarafından oluşturulan bir bitki InsP profilinden farklar bilinmemektedir, çünkü bu tür karşılaştırmalar bitkilerde yapılmamıştır. Hayvan hücreleri üzerinde yapılan yeni bir çalışmada bu soru46ele alınmıştır. Bu çalışmada, glukoz-6-fosfattan doğrudan türetilmiş olması gereken [3H]-myo-inositol etiketleme tarafından görülemeyen insP6 havuzu, SAX-HPLC profilleri nin memeli hücre hatlarının PAGE jelleri ile karşılaştırılması yla tanımlanmıştır. 24 saat fosfat açlığı, TiO2 pulldown kullanılarak saflaştırılan InsPs PAGE jellerini ölçerken InsP6’da %150’lik bir artışa yol açtı. [3 H]-myo3-inositol etiketli hücrelerin sax-HPLC analizleri aynı şekilde tedavi edilen hücrelerin sadece %15 oranında bir artış gösterdiğini[3H]-InsP6. Daha önce de belirtildiği gibi, InsP5’ten daha düşük InsPs çoğu durumda PAGE analizi ile tespit edilemez. SAX-HPLC’nin ardından gelen radyoetiketleme, kütle spektrometrik protokolleri bu negatif yüklü molekül grubunu tespit etmek için optimize edilmedikçe tercih edilen yöntem gibi görünmaktadır.
Kalan bir diğer zorluk sax-HPLC analizlerinde (veya InsP analizi için başka bir yöntemde)10,,17enantiomerleri ayırt etmektir. Bu sorun chiral seçiciler eklenmesi ile ele alınabilir, yani, L-arginin amid gibi enantiopure bileşiklerin ilgili enantiomerik moleküller ile etkileşim e-diyanjiyom kompleksleri oluşturmak için10. Bildiğimiz kadarıyla, bu yaklaşım sadece enantiomerik InsP5 izomerleri InsP5 [1-OH] ve InsP5 [3-OH] NMR analizleri10tarafından ayırt etmek için uygulanmıştır. Diğer enantiomerik çiftlerin ayrımcılığı veya chiral SAX-HPLC analizi veya chiral PAGE tabanlı yöntemlerle enantiomerlerin başarılı bir şekilde ayrımcılığı henüz rapor edilmemiştir ve daha da geliştirilmelidir. Korunmuş sentezi ve pp-InsPs korunmuş düzenleme fosfor kullanılabilirliği ile göz önüne alındığında, biz page veya MS tabanlı yöntemler gibi özellikle radyoaktif olmayan yöntemler, besin analizleri ile birlikte, bitkileri besin eksiklikleri teşhis etmek için tasarlanmış uzaktan algılama verileri kalibre etmek için zemin doğrulayıcı çabaları yardımcı olacağını öngörüyoruz17,18,24,25. Ancak, burada sunulan yöntem şu anda hala InsP analizleri için altın standart olarak kabul edilebilir ve bitkilerde bu ilginç haberciler yeni işlevleri keşfetmek için etkili olacaktır.
The authors have nothing to disclose.
Bu çalışma Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, Alman Araştırma Vakfı) tarafından Almanya’nın Mükemmellik Stratejisi kapsamında finanse edilmiştir – EXC-2070 – 390732324 (PhenoRob), Araştırma Eğitim Grubu GRK2064 ve bireysel araştırma hibe SCHA1274/4-1 ve SCHA1274/5-1 G.S.’e. Li Schlüter ve Brigitte Ueberbach’a da teknik yardımları için teşekkür ederiz.
Centrifuge | Eppendorf AG | model: 5430 R | |
Diammonium hydrogen phosphate, ≥97 % | Carl Roth GmbH + Co. KG | 0268.1 | |
Ethylenediamine tetraacetic acid disodium salt dihydrate, ≥99 %, p.a., ACS | Carl Roth GmbH + Co. KG | 8043.2 | |
Falcon 12-well clear flat bottom TC-treated multiwell cell culture plate, with lid, individually wrapped, sterile | Corning Inc. | 353043 | |
Fraction collector | LAMBDA Instruments GmbH | model: OMNICOLL single channel collector | |
Growth incubator | poly klima GmbH | model: PK 520-LED | |
HPLC pumps | Kontron Instruments | model: 420 | |
HPLC syringe for Rheodyne valves, 1 mL | Hamilton Company | 81365 | |
Injector for HPLC | Supelco | model: Rheodyne 9725 | |
Inositol, myo-[1,2-3H(N)] | American Radiolabeled Chemicals Inc. | ART 0261 | |
Liquid nitrogen | University, Chemistry Department | ||
Liquid scintillation counter | PerkinElmer Inc | model: TRI-CARB 2900TR | |
Micro pestle | Carl Roth GmbH + Co. KG | CXH7.1 | |
Mixed cellulose Eester filter, ME range (ME 24), plain, 0.2 µm pore size, 47 mm circle | GE Healthcare Life Sciences | 10401770 | |
Mixer for HPLC | Kontron Instruments | model: M 800 | |
Murashige & Skoog medium, salt mixture | Duchefa Biochemie | M0221 | |
OriginPro software | OriginLab Corp. | ||
Orthophosphoric acid, ≥85 %, p.a., ISO | Carl Roth GmbH + Co. KG | 6366.1 | |
Partisphere 5 µm SAX cartridge column, 125 x 4.6 mm | Hichrom Limited | 4621-0505 | |
Perchloric acid, 70 %, 99.999 % trace metals basis | Sigma-Aldrich | 311421 | |
Petri dish, square, PS, clear, 120/120/17 mm, sterile | Greiner Bio One International GmbH | 688161 | |
pH-indicator paper pH 5.5 – 9.0, Neutralit | Merck KGaA | 109564 | |
Phytagel | Sigma-Aldrich | P8169 | |
Potassium carbonate | Carl Roth GmbH + Co. KG | P743.2 | |
Safe-Lock tubes, 1.5 mL | Eppendorf AG | 30120086 | |
Sample loop for 9725 injectors, volume 2 mL, PEEK | Supelco | 57648 | |
SNAPTWIST scintillation vial, 6.5 mL | Simport Scientific Inc. | S207-5 | |
Sterile bench | LaboGene | model: ScanLaf MARS 900 | |
Sucrose, ≥99,5 %, p.a. | Carl Roth GmbH + Co. KG | 4621.1 | |
Ultima-Flo AP liquid scintillation cocktail | PerkinElmer Inc | 6013599 | |
Ultra-pure deionized water | Milli-Q | ||
Wrenchless WVS End Fitting Kit | Hichrom Limited | 4631-1001 |