המודל הרומן תלת מימדי המבוסס על האינטראקציה הטרולימית של תאי הגידול והריטרותקיעות מסטרומה. כאן, אנו מציגים התרבות הcoculture של תאים סרטניים מסטרומה, הדמיה של הזמן, ו מיקרוסקופ קונפוקלית כדי להמחיש את היווצרות של spheroids. זה מודל תלת מימדי מציע פלטפורמה רלוונטית ללמוד אינטראקציות הגידול משתית ולבדוק therapeutics סרטן.
הגידול-משתית אינטראקציות לשחק תפקיד חשוב בהתקדמות הסרטן. תלת מימדי (3D) מודלים הגידול ספרואיד הם הנפוצים ביותר במודל מבחנה במחקר של סרטן גזע/ייזום תאים, טרום קלינית לחקר הסרטן, והקרנת סמים. 3D מודלים ספרואיד הם מעולים על התרבות הקונבנציונלית תאים סרטניים ולשכפל כמה תווים חשובים של גידולים מוצק אמיתי. עם זאת, קונבנציונאלי 3D הגידול מורכב באופן בלעדי של תאים סרטניים. הם חסרי השתתפות של תאים סטרומה הגידול ואין להם מספיק מטריצה החילוץ (ECM) התצהיר, ובכך רק חלקית מחקה את התנאים vivo של רקמות הגידול. הקמנו מודל חדש מדור 3D ספרואיד מורכב מתאי הגידול סטרומה פיברותקיעות כי טוב יותר מחקה את הvivo הגידול הטרוגנית מיקרוסביבה הdesmoplasia שלה יליד. היווצרות של spheroids מוסדר באופן מוחלט על ידי מסטרומה הגידול פיברותקיעות והוא נקבע על ידי הפעילות של מסלולים מסוימים המכריע מאוד תאיים (למשל, איתות חריץ) ב פיברוביטים מסטרומה. במאמר זה, אנו מציגים את הטכניקות של התרבות התאית של תאים סרטניים מסטרומה, הדמיה זמן לשגות כדי להמחיש אינטראקציה תא תאים, ו מיקרוסקופ קונפוקלית כדי להציג את התכונות האדריכליות 3d של spheroids. אנו מראים גם שתי דוגמאות של היישום המעשי של מודל זה ספרואיד תלת-ממד. מודל זה הרומן מסחר 3D ספרואיד מציעה פלטפורמה שימושית ללימוד הגידול משתית, להבהיר כיצד סטרומה לווסת סרטן גזע/ייזום תאים, אשר קובעים את התקדמות הגידול ותוקפנות, ולחקור מעורבות של תגובת סטרומה ברגישות לתרופות בסרטן והתנגדות. הפלטפורמה הזאת יכולה להיות גם. מודל מתורבת לגילוי סמים
גידולים מוצקים לייצג רקמות מורכבות המורכב מתאים נאופלסטיים ומגוון גדול של תאים סטרומה1,2,3,4. סטרומה פיברותקיעות, או סרטן הקשורים פיברותקיעות (קפה), הם אחד האוכלוסיות הבולטות של תאים סטרומה ברוב סוגי גידולים מוצקים. הם מעורבים אנושות בוויסות צמיחת הגידול, סטדיות, גרורות, אנגיוגנזה, ועמידות בפני סמים באמצעות ייצור גורמי גדילה, ציטוקינים/נוגדנים, סינתזה של ecm ואנזימים שיפוץ (למשל, קולגן, פיברוטין, ומטריקס מטאלופרוטסיס), שחרור אקסוזומים, ואינטראקציה ישירה של תא לתא הטרוטיפקס5,6,7,8,9,10,11 . קפה גם לקחת חלק בקביעת גרורות האיבר הספציפי לסרטן ידי מראש בחירת תת קבוצה של שיבוטים הגידול מאוכלוסיות הטרוגנית תאים סרטניים בנגע העיקרי וטיפוח אלה שיבוטים שנבחרו להיות מוכן גרורות לאיבר מרוחק ספציפי אשר מיקרוסביבה אופטימלית לצביעה מפני השיבוטים של שיבוטים שנבחרו12. יתר על כן, פיברותקיעות וגורמים מסיסים המופרשים שלהם ecm להשתתף באפנון של אנגיוגנזה הגידול13,14, נגד הגידול התגובה החיסונית15, והם מעורבים גם התנגדות לסמים והגידול מהישנות16,17.
בשנת מתורבת 3d הגידול מודלים ספרואיד פותחו ומשמש מחקר הסרטן כמודל ביניים בין תרביות תאים מבחנה בסרטן ובדגמי גידול vivo18,19,20,21. מודלים 3D הגידול ספרואיד זכו לפופולריות במחקר תאי גזע סרטן, טרום קלינית לחקר הסרטן, והקרנת סמים משום שמודלים אלה לשכפל כמה תכונות חשובות של גידולים אמיתיים שנעדרים ב-2D מסורתית מונאולאיירס22. רבים קיימים 3D הגידול מודלים ספרואיד היוו אך ורק של תאים סרטניים וחוסר השתתפות של תאים סטרומה הגידול. זה לעתים קרובות תוצאות spheroids הגידול נתקל לא מספיק התצהיר ECM והיעדר אינטראקציות תא תאים הטרוטיפקס. קונבנציונאלי 3D spheroids נוצר באופן בלעדי על ידי תאים סרטניים הומוטיפקס תא התא הדבקה עשוי רק חלקית לחקות את התנאים vivo של רקמות הגידול. כדי להתגבר על חלק ממגבלות אלה, החוקרים הציעו לשלב סוגים מרובים של תאים סטרומה בתרבויות 3d ופיתח מספר הטרוטיפ 3d גידול ספרואיד מודלים23,24,25,26,27. בנוסף, החוקרים המועסקים מטריצות 3d אקסוגני, כולל הידרוג’לים טבעיים או פולימרים סינתטיים כגון פוליאתילן גליקול, פולי (lactide-co-גליקולדה), ו פולי (N-איזוקטילאמילאמיד), להטביע מודלים מונותאיים ומרב הספרואיד, יצירה של סביבה תומכת בתאים ומשחזר אינטראקציות תאים מטריצות28,29, ובכך להפוך את המערכות ה עם זאת, שילוב של סוגים מסוימים של תאים סטרומה, כגון תאים אנדותל, בתרבויות 3D מביא על מורכבות נוספת עבור מערכת מבחנה ומקשה על ללמוד אינטראקציות תא תאים הטרוטיפקס בין שני סוגים ספציפיים של תאים, כגון אינטראקציות תאים סרטניים הפיצוץ. יתר על כן, תאים אנדותל ברקמות אמיתי לא תמיד אינטראקציה ישירה עם תאים סרטניים ותאים אחרים סטרומה כי יש שכבה של קרום המרתף עטוף מחוץ נימים המונע תאים אנדותל מאינטראקציה ישירה עם תאים סרטניים ותאים אחרים סטרומה. במודלים ספרואיד תלת-ממדיים, משולבים בתאי האנדותל, אינם יוצרים בעצם כלי דם, אך מתקשרים ישירות עם תאים סרטניים ותאי סטרומה אחרים, דבר שלעיתים נדירות מתרחש בvivo. באופן דומה, מטריצות אקסודוגני המועסקים בכמה מודלים ספרואיד תלת-ממד אינם זהים ECM ברקמות הגידול האמיתי במונחים של מבנה וקומפוזיציה. כל התנאים המלאכותית האלה עלולים לגרום לנתונים מטעים.
לאחרונה יצרנו מודל חדש של 3D ספרואיד מגוון מורכב של תאים סרטניים ו-בית קפה. במודל שלנו, היווצרות spheroids הגידול 3D נקבע לחלוטין על ידי קפה. קפה לגרום ולווסת את הפנוטיפ של גזע הגידול/מתחיל תאים. ECM המיוצר על ידי קפה הוא טבעי ומאפשר את המבנה desmoplastic כדי לחקות טוב יותר את vivo הגידול בסביבת מיקרו. זה מודל 3D הרומן יכול להיות כלי שימושי עבור הקרנת תרופות לסרטן ומציעה פלטפורמה ייחודית ללמוד אינטראקציה הגידול משתית, להבהיר כיצד לווסת את הסרטן גזע/ייזום תאים, ולחקור את המעורבות של אינטראקציות סטרומה בסרטן רגישות לתרופות והתנגדות.
בשנת מתורבת 3D טכניקות תרבות תאים המועסקים באופן נרחב במשך עשורים במחקר סרטן. בהשוואה למערכות התרבות הרגילות של תאים דו-ממדיים, המיקרו-סביבה התלת-ממדית מאפשר לחקות את תאי התא ו/או את האינטראקציות של מטריצת התאים ומאפשרת חיקוי של התנאים המקוריים שנצפו ברקמות הגידול. עם זאת, מערכת תלת-ממד שהוקמה רק על-ידי תאים סרטניים ואינטראקציות תא הומותאיות לא לקחת בחשבון את החשיבות של דיבור הטרוטיפקס והוא עשוי לספק תוצאות לא מדויקות במחקר. פיתחנו לאחרונה מערכת 3D הרומן שילוב תאים סרטניים ו-בית קפה כדי לחקות טוב יותר מיקרוסביבה vivo הטרוגנית הגידול ותגובה desmoplastic מקורית ונוקשה שלה.
פיברותקיעות הם מרכיבים עיקריים של משתית גידולים. קפה מעורבים בוויסות התקדמות הגידול על ידי מעורר גורמים מסיסים, ECM/שיפוץ אנזימים10,11, אקסוזומים. בנוסף, קפה לשחק חלק בהתנגדות לסמים ולהישנות הגידול16,17. מערכת 3D שלנו ספרואיד מדור שלנו יכול להיות מנוצל כדי לחקור מנגנונים מולקולרית של אינטראקציות הגידול סטרומה וכדי לטפל בהתנגדות לסמים ולהישנות הגידול. קפה מופק בעיקר מתוך מופעל השקט המקומי פיברוהתקיעות ו מגויס מח עצם העצמות MSC, אשר עוברים בידול באתרו לתוך הסרטן ברקמות הגידול37,38,39. במחקר הנוכחי, השתמשנו בפיברוטימיט עור כדי ליצור מודל 3D ספרואיד מגוון. עם זאת, סוג אחר של פיברותקיעות (למשל, MSC-DF), גם לעבוד בצורה דומה מאוד כמו העור פיברותקיעות כדי לווסת את תא הגידול 3D ספרואיד היווצרות34. MSC-DF יכול להיווצר מח עצם מוריין MSC, אשר מועשר על ידי מח עצם culturing ברור תאים בינונית התרבות של הגוף MSC במשך כ 10 ימים עם שינויים בינוניים תקופתיים כל 3 ימים. MSC אלה מאופיינים כ-CD73+/cd105+/Lin–. כדי להבדיל את MSC לתוך פיברוהפיצוצים, MSC הם מתורבתים לאחר מכן עם DMEM להשלים 2 שבועות נוספים. MSC-DF מאופיינים α-SMA+/vimentin+/vimentin+ תאים36. MSC-DF יכול להיות הרגולטורים הגידול חשוב. מכיוון שבריר של קפה בסוגים רבים של גידולים מוצקים מובחנים מ-MSC מגויס במחזור שוחרר מח עצם36, MSC-DF יכול להיות מבטיח מטרות הטיפול. הם גם הרבה יותר בקלות מניפולציות מבחינה רפואית או ממוקד לפני שהם גויסו רקמות הגידול והבדיל לתוך קפה. כך, מודל תלת-ממד שלנו מציע מערכת אידיאלית ללמוד ולבדוק לא רק תאים סרטניים, אלא גם שברים שונים או תת אוכלוסיות של קפה. השיטה עבור היווצרות 3D ספרואיד היא פשוטה. השלבים הקריטיים כוללים שימוש בסרום חינם לתרבות החברה, ומיישם את היחס הנכון של הפיברותקיעות לתאי גידול, ובאמצעות לוחות התרבות הנכונים לתרבות החברה. המגבלה הפוטנציאלית של השיטה שלנו היא כי היווצרות של spheroids 3D הוא תא סרטן ברובו תלוי קו. פרוטוקול היווצרות הספרואיד שלנו עשוי לדרוש אופטימיזציה של היחס בין פיברותקיעות ותאי סרטן אם שונים תאים סרטניים מועסקים. יש לציין כי השתמשנו תא מלנומה של האדם והעכבר פיברוההדף מודל coculture פיצוץ המודל עבור היווצרות של 3D spheroids, כי זה הרבה יותר קל ליצור GOF או LOF תאים בתוך העכבר פיברותקיעות לחקר התפקיד של מולקולה או מסלול איתות בוויסות היווצרות הגידול ספרואיד. היכולת של תאים מלנומה אנושית והעכבר פיברותקיעות לטופס spheroids מציין כי מולקולות הדרושות עבור תקשורת תא תא עבודה לחצות מינים. יש לנו נבדק לאחרונה התרבות coculture האדם עם תאים מלנומה האדם ומצאו כי הגידול האנושי יכול גם לווסת תאים מלנומה אנושית כדי ליצור spheroids 3D.
אנו המועסקים תאים מלנומה גרורתית האדם, C8161, במודל שלנו 3D ספרוoid שלנו. בדקנו גם תאים אחרים מלנומה אנושית, למשל, 1205Lu32, אשר נושאת אתV600E braf מוטציה, ו mewo, אשר מבטא רמות גבוהות של CDK4/קיט (atcc htb-65), ומצא כי הם גם מסוגלים ליצור Spheroids 3d ב-coculture. זה מצביע על היווצרות של spheroids 3D על ידי תאים סרטניים אינו תלוי בסוגים של מוטציות אונגניים. למרות שאנחנו לא בדקנו אם סוגים אחרים של תאים סרטניים שאינם מלנומה מסוגלים להרכיב spheroids 3D עם פיברותקיעות, הממצאים שלנו מצביעים על כך היווצרות של 3D spheroids לא מוגבל לקו תא מלנומה ואולי לא תלוי קו תאים מסוים הסרטן.
הראנו שתי דוגמאות של יישומים מעשיים של המודל התלת-מימדי שלנו. דוגמא אחת הייתה להבהיר את פעילות המסלול הבין-תאיים העולה בוויסות מבנה הסרטן/הייזום של תאי התאים והיווצרות תלת-ממד. הדגמנו את מסלול האיתות התאיים העולה בקפה הוא מתג מולקולרי השולט בפנוטיפ של הגזע הסרטני/היוזם תאים באמצעות מודל זה ספרואיד תלת-ממדי. הממצאים שלנו לא רק לחשוף מנגנון מולקולרי הבסיס מסטרומה רגולציה של סרטן גזע/ייזום תאים סרטן הטרוגניות, אבל גם להדגיש כי מסלול חריץ ב-בית קפה הוא יעד קריטי עבור therapeutics מלנומה. דוגמה זו מציינת כי המודל שלנו 3D ספרואיד שימושי מאוד כדי ללמוד את המנגנונים עבור הסרטן מסטרומה תאים הטיפול בפיברופיצוץ ולזהות מטרות טיפוליות פוטנציאליות. דוגמה נוספת הייתה לבדוק את תגובת התרופה של סרטן גזע/מתחיל תאים בנוכחות של קפה. ידוע היטב כי תגובת התרופה של תאים סרטניים, כולל סרטן גזע/ייזום תאים, משתנה בנוכחות והעדר של קפה. נוכחות של קפה זה במערכת החוץ גופית עושה את המודל הזה יותר קליני רלוונטי תוצאות הבדיקה אמין יותר. יתר על כן, המערכת שלנו 3D ספרוoid הוא צדדי. ניתן להשתמש בו למטרות שונות. לדוגמה, אם תאים סרטניים עמידים בפני תרופות מועסקים במודל תלת-ממד זה, ניתן לשנות את הטיפול בהתנגדות לסמים ואולי להישנות הגידול. זה יכול גם להיות שונה כדי לבדוק או המסך תרופות המיועד בעיקר קפה לטיפול בסרטן. קפה הפכה לאחרונה למטרות טיפוליות מבטיחות. יש יתרונות למיקוד בקפה. ראשון, לעומת התאים הסרטניים כי הם חריגים (לעתים קרובות עם שינויים גנטיים) וחכם (בקלות לקבל עמידות כימותרפיה-רדיותרפיות), קפה ברקמת הגידול הם תאים נורמליים ויציבה יותר גנטית, כך הם פחות סביר לפתח עמידות לטיפולים. שנית, מיקוד בקפה אינו תלוי בסוג של מוטציות אונגניים בתאי הגידול. השלישי, מיקוד בקפה עשוי להשיג תופעות להיט מרובים באמצעות אנטי הגידול התלוי בגידולים, אנטי אנגיוגנזה, ו/או התגובה החיסונית של סרטן מודליטינג. מודל 3D ספרואיד שלנו הוא כלי רב עוצמה עבור גילוי של קבוצות מגוונות של אסטרטגיות טיפוליות לסרטן.
The authors have nothing to disclose.
אנו מודים לד ר אואידה ג. ולאסקז (אונ’ מיאמי) לשיתוף פעולה, ייעוץ ודיון מועילים; ד ר ג’אי לי (אוניברסיטת מיאמי) לאספקת תאים MeWo; וד ר Meenhard הרלין (מכון Wistar) עבור מתן כל תאי מלנומה אחרים. אנו מודים גם ד ר מרשה בובינה, מנהל מתקן ליבת הדמיה אנליטית, אוניברסיטת מיאמי, לניתוח דימות. ז’או-ג’ון ליו נתמך על ידי מענקים מתוכנית המחקר לסרטן בנקהד-Coley (פרס 09BN 11), האגודה לסרטן נשים (המענקהשנתי 53 ) וקרנות פנימיות מאוניברסיטת מיאמי.
0.25% Trypsin-EDTA | Corning | 25-253-CI | |
24-well plate | Corning | 351147 | Non-tissue culture treated plate, 24-well, flat bottom with low evaporation lid |
Alex Fluor 488 goat anti-mouse IgG | Life Technology | A21202 | |
CaCl2 1.5 M | Sigma-Aldrich | C5670-500G | |
Collagenase, Type 1A | Sigma-Aldrich | C-2674 | 500 mg, 1 mg/mL concentration in DMEM. |
DakoCytomation | Dako | x0909 | |
DAPI | |||
Dispase Grade II | Roche Diagnostics | 165859 | |
Dulbecco's Modified Eagle's Medium(DMEM) | Corning | 10-013-CV | |
Fetal Bovine Serum | VMR | 97068-085 | Premium Grade |
Fiji (ImageJ) | NIH | Free for downloading, no license needed. | |
IncuCyte Zoom 2016A | Essen Bioscience | ||
IncuCyte Zoom System | Essen Bioscience | ||
Insulin | Sigma-Aldrich | I1882 | |
L-15 Medium (Leibovitz) | Sigma-Aldrich | L1518 | |
Leica SP5 Inverted Confocal Microscope | Leica | ||
MCDB 153 Medium | Sigma-Aldrich | M7403-10X1L | |
Mouse anti α-SMA (smooth muscle actin), monoclone | Abcam | ab18640 | |
Olympus IX51 Inverted Fluorescence Microscope | Olympus | IX51 | |
Olymupus CellSens | Olympus | ||
PD0325901 | Selleckchem Chemicals | S1036 | |
Penicillin Streptomycin Solution | Corning | 30-002- CI | 100 X |
Sodium Bicarbonate 7.5% | Corning | 25-035-CI |