Um novo modelo esferoide tridimensional baseado na interação heteroplípica das células tumorais e fibroblastos estrômios é estabelecido. Aqui, apresentamos cocultura de células tumorais e fibroblastos estrômicos, imagens de lapso de tempo e microscopia confocal para visualizar a formação de esferoides. Este modelo tridimensional oferece uma plataforma pertinente para estudar interações tumor-stroma e testar a terapêutica do câncer.
As interações tumorais-stroma desempenham um papel importante na progressão do câncer. Modelos de esferoide tumorais tridimensionais (3D) são os modelos in vitro mais utilizados no estudo de células cancerígenas/inatidas, pesquisa de câncer pré-clínico e rastreamento de medicamentos. Os modelos esferoides 3D são superiores à cultura convencional das células tumorais e reproduzem alguns personagens importantes de tumores sólidos reais. No entanto, os esferoides tumorais 3D convencionais são compostos exclusivamente por células tumorais. Faltam a participação de células estrumárias tumorais e possuem deposição insuficiente de matriz extracelular (ECM), imitando parcialmente as condições in vivo dos tecidos tumorais. Estabelecemos um novo modelo esferoide 3D multicelular composto por células tumorais e fibroblastos estrômicos que imita melhor o microambiente tumoral heterogêneo in vivo e sua desmoplasia nativa. A formação de esferoides é estritamente regulada pelos fibroblastos estrômios tumorais e é determinada pela atividade de certas vias de sinalização intracelular cruciais (por exemplo, sinalização de entalhe) em fibroblastos estrômios. Neste artigo, apresentamos as técnicas de cocultura de fibroblastos tumorais-estrônomo, imagens de lapso de tempo para visualizar interações células-células e microscopia confocal para exibir as características arquitetônicas 3D dos esferoides. Também mostramos dois exemplos da aplicação prática deste modelo esferoide 3D. Este novo modelo esferoide 3D multicelular oferece uma plataforma útil para estudar a interação tumoral-stroma, elucidando como fibroblastos estrômios regulam células cancerígenas/iniciantes, que determinam a progressão e a agressividade do tumor, e exploram o envolvimento da reação estrária na sensibilidade e resistência dos medicamentos cancerosos. Esta plataforma também pode ser um modelo in vitro pertinente para a descoberta de drogas.
Tumores sólidos representam tecidos complexos compostos por células neoplásticas e uma grande variedade de células estrumárias1,2,3,4. Os fibroblastos estrumes, ou fibroblastos associados ao câncer (CAF), são uma das populações de células estrume proeminentes na maioria dos tipos de tumores sólidos. Estão criticamente envolvidos na regulação do crescimento tumoral, caule, metástase, angiogênese e resistência medicamentosa através da produção de fatores de crescimento, citocinas/quimokinas, síntese de ECM e enzimas remodeladoras (por exemplo, colágeno, fibronectina e metaloproteases matriciais), liberação de exosóis e interação direta heteroptípica celular-célula5,6,7,8,9,10, 101 , 101 , 101 , 101 . A CAF também participa na determinação da metástase específica do órgão cancero, pré-selecionando um subconjunto de clones tumorais de populações de células tumorais heterogêneas na lesão primária e fomentando esses clones selecionados para serem preparados para metástase a um órgão distante específico cujo microambiente é ideal para a recolonização de clones selecionados12. Além disso, os fibroblastos e seus fatores solúveis secretos e o ECM participam da modulação da angiogênese tumoral13,14, resposta imune antitumoral15, e estão até envolvidos na resistência a medicamentos e recidiva do tumor16,17.
Modelos de esferoide sheróide suofóide sufóis in vitro foram desenvolvidos e utilizados na pesquisa do câncer como modelo intermediário entre culturas celulares in vitro cancerosas e modelos in vivo tumoristo 18,19,20,21. Os modelos de esferoide tumoral 3D ganharam popularidade na pesquisa de células-tronco do câncer, pesquisa de câncer pré-clínico e rastreamento de medicamentos porque esses modelos reproduzem algumas características importantes de tumores reais que estão ausentes em monocamadas 2D tradicionais22. Muitos modelos esferoides tumorais 3D existentes são constituídos exclusivamente por células tumorais e não têm a participação de células estróides tumorais. Isso muitas vezes resulta em esferoides tumorais com deposição insuficiente de ECM e ausência de interações células-células heterotépicas. Esferoides 3D convencionais formados exclusivamente por células cancerosas e adesão homoppicacelular célula-célula só podem imitar parcialmente as condições in vivo dos tecidos tumorais. Para superar algumas dessas limitações, os pesquisadores propuseram incorporar vários tipos de células estrumárias em coculturas 3D e desenvolveram vários modelos de esferoide tumoral heterotipo 3D23,24,25,26,27. Além disso, os investigadores empregaram matrizes 3D exógenas, incluindo hidrogéis naturais ou polímeros sintéticos como polietileno glicol, poli (lactide- co-glicolide) e poli (N-isopropylacrilamida), para incorporar modelos de esferoide monocelular e multicelular, criando um ambiente de suporte celular e reproduzindo interações matrizes celulares28,29,tornando esses sistemas mais biologicamente relevantes30. No entanto, a incorporação de certos tipos de células estrôteras, como células endoteliais, em coculturas 3D traz complexidade adicional para um sistema in vitro e dificulta o estudo de interações heteroptípicas células celulares entre dois tipos específicos de células, como interações células-fibroblasto cancerosas. Além disso, as células endoteliais em tecidos reais nem sempre interagem diretamente com células cancerosas e outras células estrônes porque há uma camada de membrana do porão envolta fora dos capilares que impede que as células endoteliais interajam diretamente com células cancerosas e outras células estrônes. Nesses modelos esferoides 3D, as células endoteliais incorporadas não formam vasos sanguíneos, mas interagem diretamente com células cancerígenas e outras células estrôteras, algo que raramente ocorre no vivo. Da mesma forma, matrizes exógenas empregadas em alguns dos modelos esferoides 3D não são idênticas ao ECM em tecidos tumorais reais em termos de estrutura e composição. Todas essas condições artificiais podem resultar em dados enganosos.
Recentemente criamos um novo modelo esferoide 3D multicelular composto por células tumorais e CAF. No nosso modelo, a formação de esferoides tumorais 3D é inteiramente determinada pela CAF. O CAF induz e regula o fenótipo das células de tronco/início do tumor. O ECM produzido pela CAF é natural e permite que a estrutura desmoplástica imite melhor o microambiente tumoral in vivo. Este novo modelo 3D pode ser uma ferramenta útil para o rastreamento de medicamentos contra o câncer e oferece uma plataforma única para estudar a interação tumoral-stroma, elucidar como a CAF regula o câncer/instituir células, e explorar o envolvimento de interações estrumárias na sensibilidade e resistência de medicamentos cancerígenos.
As técnicas de cultura celular 3D in vitro têm sido amplamente empregadas há décadas em pesquisa sobre câncer. Em comparação com os sistemas convencionais de cultura celular 2D, o microambiente 3D recapitula as interações celular-célula e/ou matriz celular e permite imitar as condições genuínas observadas nos tecidos tumorais. No entanto, um sistema 3D formado apenas por células cancerígenas e interações homopípicas celulares não leva em conta a importância da conversa cruzada heterotípica e pode fornecer resultados imprecisos na pesquisa. Recentemente desenvolvemos um novo sistema 3D que combina células cancerígenas e CAF para melhor imitar no microambiente tumoral heterogêneo vivo e sua reação desmoplástica nativa e dura.
Fibroblastos são componentes principais do estroma tumoral. A CAF está envolvida na regulação da progressão tumoral, provocando fatores solúveis, enzimas ECM/remodelação10,11e exosóis. Além disso, a CAF desempenha um papel na resistência a medicamentos e recidiva do tumor16,17. Nosso sistema multicelular de esferoide 3D pode ser utilizado para explorar mecanismos moleculares de interações tumorais-estrôqueis e para lidar com a resistência medicamentosa e recidiva do tumor. O CAF é derivado principalmente de fibroblastos quiescentes locais ativados e recrutados circulando msc de medula óssea, que se submetem em diferenciação in situ para CAF no tecido tumoral37,38,39. No presente estudo, usamos fibroblastos de pele para criar um modelo esferoide 3D multicelular. No entanto, outro tipo de fibroblastos (por exemplo, MSC-DF), também funcionam de forma muito semelhante aos fibroblastos da pele para regular a formação esferoide 3D da célula tumoral3D. O MSC-DF pode ser gerado a partir da medula óssea murina MSC, que é enriquecida por cultivar células mononucleares de medula óssea em meio smsc cultura celular por cerca de 10 dias com mudanças médias periódicas a cada 3 dias. Estes MSC são caracterizados como CD73+/CD105+/Lin–. Para diferenciar o MSC em fibroblastos, o MSC é posteriormente cultivado com DMEM completo por mais 2 semanas. MSC-DF são caracterizados como α-SMA+/Vimentin+/FSP-1+ células36. O MSC-DF pode ser importantes reguladores tumorais. Como uma fração de CAF em muitos tipos de tumores sólidos são diferenciadas do MSC circulante recrutado liberado da medula óssea36, o MSC-DF pode ser promissor a metas de tratamento. Eles também são muito mais facilmente manipulados ou direcionados terapêuticamente antes de serem recrutados para tecidos tumorais e diferenciados para o CAF. Assim, nosso modelo 3D oferece um sistema ideal para estudar e testar não apenas células cancerosas, mas também diferentes frações ou subpopulações de CAF. O método para formação esferoide 3D é simples. Os passos críticos incluem o uso de meio livre de soro para cocultura, aplicação da razão certa de fibroblastos às células tumorais e o uso das placas culturais certas para cocultura. A limitação potencial do nosso método é que a formação de esferoides 3D é em grande parte dependente da linha celular cancerosa. Nosso protocolo de formação esferoide pode exigir otimização da razão entre fibroblastos e células cancerosas se diferentes linhas de células cancerígenas forem empregadas. Deve-se notar que usamos um modelo de cocultura celular de melanoma humano e célula de fibroblasto rato para a formação de esferoides 3D, pois é muito mais fácil criar células GOF ou LOF em fibroblastos de camundongos para o estudo do papel de uma molécula ou sinalização de caminho na regulação da formação de esferoides tumorais. A capacidade das células de melanoma humano e fibroblastos de camundongos para formar esferoides indica que as moléculas necessárias para as comunicações celulares funcionam entre espécies. Recentemente testamos a cocultura de fibroblastos humanos com células de melanoma humano e descobrimos que os fibroblastos humanos também podem regular as células de melanoma humano para formar esferoides 3D.
Empregamos células de melanoma metastático humano, C8161, em nosso modelo multicelular de esferoide 3D. Também testamos outras células de melanoma humano, por exemplo, 1205Lu32, que carrega a mutação BRAFV600E, e meWo, que expressa altos níveis de CDK4/Kit (ATCC HTB-65), e descobriu que elas também são capazes de formar esferoides 3D na cocultura. Isso indica que a formação de esferoides 3D por células tumorais é independente dos tipos de mutações oncogênicas. Embora não tenhamos testado se outros tipos de células tumorais não melanoma são capazes de formar esferoides 3D com fibroblastos, nossos achados indicam que a formação de esferoides 3D não se limita a uma linha celular de melanoma e pode não depender de uma linha específica de células cancerosas.
Mostramos dois exemplos de aplicações práticas do nosso modelo esferoide 3D. Um exemplo foi elucidar a atividade intracelular de sinalização de entalhe na regulação do fenótipo celular de câncer/início e formação de esferoides 3D. Demonstramos que a via intracelular de sinalização notch no CAF é um interruptor molecular que controla o fenótipo das células de câncer/início usando este modelo esferoide 3D. Nossos achados não só descobrem um mecanismo molecular subjacente à regulação estrumária de células com tronco/início do câncer e heterogenicidade do câncer, mas também destacam que o caminho notch no CAF é um alvo crítico para a terapêutica do melanoma. Este exemplo indica que nosso modelo esferoide 3D é muito útil para estudar os mecanismos para interações de fibroblasto celular-estromal de células cancerígenas e identificar potenciais alvos terapêuticos. Outro exemplo foi testar a resposta medicamentosa de células cancerígenas/intitantes na presença de CAF. É sabido que a resposta medicamentosa das células cancerígenas, incluindo células cancerígenas/de início, varia na presença e ausência de CAF. A presença de CAF neste sistema in vitro torna esse modelo mais relevante clinicamente e gerou resultados de testes mais confiáveis. Além disso, nosso sistema de esferoide 3D é versátil. Pode ser usado para vários propósitos. Por exemplo, se as células cancerígenas resistentes a medicamentos forem empregadas neste modelo 3D, ela pode ser alterada para enfrentar a resistência medicamentosa e talvez a recidiva do tumor. Também pode ser modificado para testar ou testar medicamentos que visam principalmente o CAF para o tratamento do câncer. A CAF tornou-se recentemente alvos terapêuticos promissores. Há vantagens em mirar caf. Primeiro, em comparação com células tumorais que são anormais (muitas vezes com alterações genéticas) e inteligentes (facilmente ganham resistência a quimioterapia e radioterapia), o CAF no tecido tumoral são células normais e geneticamente mais estáveis, por isso são menos propensos a desenvolver resistência aos tratamentos. Em segundo lugar, o direcionamento do CAF não depende do tipo de mutações oncogênicas nas células tumorais. Em terceiro lugar, a segmentação da CAF pode atingir múltiplos efeitos de impacto através do antitumoragenado dependente de fibroblastos, anti-angiogênese e/ou da resposta imune ao câncer modulador. Nosso modelo esferoide 3D é uma poderosa ferramenta para a descoberta de diversos conjuntos de estratégias terapêuticas contra o câncer.
The authors have nothing to disclose.
Agradecemos à Dra. Dr. Jie Li (Universidade de Miami) para fornecer células MeWo; e dr. Meenhard Herlyn (Instituto Wistar) para fornecer todas as outras células de melanoma. Agradecemos também à Dra. Zhao-Jun Liu foi apoiado por subsídios do Bankhead-Coley Cancer Research Program (Award# 09BN-11), Women’s Cancer Association (a53ª bolsa anual) e fundos internos da Universidade de Miami.
0.25% Trypsin-EDTA | Corning | 25-253-CI | |
24-well plate | Corning | 351147 | Non-tissue culture treated plate, 24-well, flat bottom with low evaporation lid |
Alex Fluor 488 goat anti-mouse IgG | Life Technology | A21202 | |
CaCl2 1.5 M | Sigma-Aldrich | C5670-500G | |
Collagenase, Type 1A | Sigma-Aldrich | C-2674 | 500 mg, 1 mg/mL concentration in DMEM. |
DakoCytomation | Dako | x0909 | |
DAPI | |||
Dispase Grade II | Roche Diagnostics | 165859 | |
Dulbecco's Modified Eagle's Medium(DMEM) | Corning | 10-013-CV | |
Fetal Bovine Serum | VMR | 97068-085 | Premium Grade |
Fiji (ImageJ) | NIH | Free for downloading, no license needed. | |
IncuCyte Zoom 2016A | Essen Bioscience | ||
IncuCyte Zoom System | Essen Bioscience | ||
Insulin | Sigma-Aldrich | I1882 | |
L-15 Medium (Leibovitz) | Sigma-Aldrich | L1518 | |
Leica SP5 Inverted Confocal Microscope | Leica | ||
MCDB 153 Medium | Sigma-Aldrich | M7403-10X1L | |
Mouse anti α-SMA (smooth muscle actin), monoclone | Abcam | ab18640 | |
Olympus IX51 Inverted Fluorescence Microscope | Olympus | IX51 | |
Olymupus CellSens | Olympus | ||
PD0325901 | Selleckchem Chemicals | S1036 | |
Penicillin Streptomycin Solution | Corning | 30-002- CI | 100 X |
Sodium Bicarbonate 7.5% | Corning | 25-035-CI |