建立了基于肿瘤细胞和基质成纤维细胞异质相互作用的新型三维球体模型。在这里,我们介绍肿瘤细胞和基质成纤维细胞的共培养,延时成像和共聚焦显微镜,以可视化球形的形成。该三维模型为研究肿瘤-频闪相互作用和测试癌症治疗提供了一个相关的平台。
肿瘤-频闪相互作用在癌症进展中起着重要的作用。三维(3D)肿瘤球体模型是癌症干细胞/启动细胞研究、临床前癌症研究和药物筛选中应用最广泛的体外模型。三维球形模型优于传统的肿瘤细胞培养,再现了真实实体肿瘤的一些重要特征。然而,传统的3D肿瘤球体完全由肿瘤细胞组成。它们缺乏肿瘤基质细胞的参与,且细胞外基质(ECM)沉积不足,因此只能部分模拟肿瘤组织的体内条件。我们建立了一个新的多细胞3D球体模型,由肿瘤细胞和基质成纤维细胞组成,更好地模仿体内异质肿瘤微环境及其原生脱模。球体的形成由肿瘤基质成纤维细胞严格调节,由基质成纤维细胞中某些关键的细胞内信号通路(例如Notch信号)的活性决定。在本文中,我们将介绍肿瘤细胞-基质成纤维细胞共培养技术,用于可视化细胞-细胞相互作用的延时成像技术,以及用于显示球形的3D结构特征的共聚焦显微镜技术。我们还展示了该 3D 球形模型的实际应用的两个示例。这种新颖的多细胞3D球形模型为研究肿瘤-频闪相互作用提供了一个有用的平台,阐明基质成纤维细胞如何调节癌症干细胞/起始细胞,从而决定肿瘤进展和攻击性,并探索基质反应在癌症药物敏感性和抗药性中的参与。该平台也可以是药物发现的相关体外模型。
实体肿瘤代表由肿瘤细胞和多种基质细胞1、2、3、4组成的复杂组织。位中成纤维细胞,或癌症相关的成纤维细胞(CAF),是大多数类型实体肿瘤中突出的基质细胞群之一。它们通过生成生长因子、细胞因子/化学因子、ECM 合成和重塑酶(例如胶原蛋白、纤维素和基质金属蛋白酶)、外体释放和直接异质细胞-细胞相互作用5、6、7、8、11、11、11、11、调节肿瘤生长、干细胞、转移、血管生成和耐药性等关键性。.CAF还参与确定癌症器官特异性转移,从原发病变的异质肿瘤细胞群中预先选择一部分肿瘤克隆,并培育这些选定的克隆,以进行转移到特定的遥远器官,其微环境最适合对选定的克隆体进行再殖民12。此外,纤维细胞及其分泌可溶性因子和ECM参与肿瘤血管生成调节13、14、抗肿瘤免疫反应15,甚至参与耐药性和肿瘤复发16、17。
体外3D肿瘤球体模型已被开发,并用于癌症研究,作为体外癌细胞培养和体内肿瘤模型18、19、20、21之间的中间模型。3D肿瘤球形模型在癌症干细胞研究、临床前癌症研究、药物筛选中已广受欢迎,因为这些模型再现了传统2D单层22中不存在的一些重要肿瘤特征。许多现有的3D肿瘤球形模型完全由肿瘤细胞组成,缺乏肿瘤基质细胞的参与。这通常导致肿瘤球体具有足够的ECM沉积和不存在异质细胞细胞相互作用。传统的3D球体完全由癌细胞和同质细胞粘附形成,只能部分模仿肿瘤组织的体内状况。为了克服其中的一些限制,研究人员建议在3D共培养中加入多种类型的基质细胞,并开发了几种异型3D肿瘤球体模型23,24,25,26,27。此外,研究人员还利用外源性3D基质,包括天然水凝胶或合成聚合物,如聚乙烯乙二醇、聚(乳酸-共甘油)和聚(N-异丙丙烯酰胺),嵌入单细胞和多细胞球形模型,创建细胞支持环境并繁殖细胞-基质相互作用28,29,从而使这些系统在生物学上更加相关。然而,将某些类型的基质细胞(如内皮细胞)结合在3D共培养中,为体外系统带来了额外的复杂性,使得研究两种特定类型细胞(如癌细胞-成纤维细胞相互作用)之间的异质细胞-细胞相互作用变得困难。此外,真实组织中的内皮细胞并不总是与癌细胞和其他基质细胞直接相互作用,因为毛细血管外有一层基底膜,可防止内皮细胞与癌细胞和其他基质细胞直接相互作用。在这些3D球形模型中,内皮细胞实际上并不形成血管,而是与癌细胞和其他基质细胞直接相互作用,这在体内很少发生。同样,某些3D球形模型中使用的外源性基质在结构和组成方面与真实肿瘤组织中的ECM不同。所有这些人为条件都可能导致误导性数据。
我们最近创建了一个由肿瘤细胞和CAF组成的新的多细胞3D球体模型。在我们的模型中,3D肿瘤球体的形成完全由CAF决定。CAF诱导和调节肿瘤干细胞的表型。CAF 产生的 ECM 是天然的,允许脱塑性结构更好地模仿体内肿瘤微环境。这一新颖的3D模型是癌症药物筛选的有用工具,为研究肿瘤-频闪相互作用提供了一个独特的平台,阐明CAF如何调节癌症干细胞/起始细胞,并探索基质相互作用在癌症药物敏感性和抗药性中的参与。
几十年来,体外3D细胞培养技术在癌症研究中得到了广泛的应用。与传统的2D细胞培养系统相比,3D微环境可重新结合细胞和/或细胞基质相互作用,并能够模拟在肿瘤组织中观察到的真实状况。然而,只有癌细胞和同质细胞-细胞相互作用形成的3D系统没有考虑到异质性串扰的重要性,并且可能在研究中提供不准确的结果。我们最近开发出一种新型的3D系统,将癌细胞和CAF相结合,以更好地模拟体内异质肿瘤微环境及其原生和僵硬的脱塑性反应。
成纤维细胞是肿瘤频闪的主要成分。CAF通过诱导可溶性因子、ECM/重塑酶10、11和外体参与调节肿瘤进展。此外,CAF在耐药性和肿瘤复发16,17中发挥作用。我们的多细胞3D球形系统可用于探索肿瘤-基质相互作用的分子机制,并解决耐药性和肿瘤复发问题。CAF主要来源于激活的局部静成纤维细胞和招募的循环骨髓MSC,在肿瘤组织37、38、39中进行原位分化为CAF。在目前的研究中,我们使用皮肤成纤维细胞创建多细胞3D球形模型。然而,其他类型的成纤维细胞(例如,MSC-DF),也以非常类似的方式作用于皮肤纤维细胞,以调节肿瘤细胞3D球形形成34。MSC-DF可以从鼠骨髓MSC生成,通过在MSC细胞培养基培养中培养骨髓单核细胞来丰富,每3天定期改变一次介质。这些 MSC 被描述为 CD73+/CD105+/Lin–。为了将 MSC 区分为成纤维细胞,MSC 随后使用完整的 DMEM 进行额外 2 周的培养。MSC-DF 被描述为 +-SMA+/维门丁=/FSP-1=细胞36。MSC-DF 可能是重要的肿瘤调节器。由于许多类型实体肿瘤中的CAF的一小部分与从骨髓36中释放的循环MSC有区别,MSC-DF是有希望的治疗靶点。在将它们招募到肿瘤组织并分化成 CAF 之前,它们也更容易被治疗操纵或瞄准。因此,我们的 3D 模型不仅为癌细胞,而且为 CAF 的不同分数或亚群的研究和测试提供了理想的系统。3D球形形成的方法非常简单。关键步骤包括使用无血清培养基用于共性培养,将成纤维细胞的正确比例应用于肿瘤细胞,以及使用正确的培养板进行共性培养。我们方法的潜在局限性是,3D球体的形成在很大程度上依赖于癌细胞系。如果采用不同的癌细胞系,我们的球形形成方案可能需要优化成纤维细胞和癌细胞之间的比例。应该指出的是,我们使用人类黑色素瘤细胞和小鼠成纤维细胞共培养模型来形成3D球体,因为在小鼠成纤维细胞中创建GOF或LOF细胞对于研究分子或信号通路在调节肿瘤球形形成中的作用要容易得多。人类黑色素瘤细胞和小鼠成纤维细胞形成球体的能力表明,细胞-细胞通信所需的分子工作是跨物种的。我们最近测试了人类成纤维细胞与人类黑色素瘤细胞的共性培养,发现人类成纤维细胞也可以调节人类黑色素瘤细胞,形成3D球形。
我们在多细胞3D球形模型中采用了人类转移性黑色素瘤细胞C8161。我们还测试了其他人类黑色素瘤细胞,例如携带BRAFV600E突变的1205Lu32和MeWo,后者表示高水平的CDK4/Kit(ATCC HTB-65),并发现它们也能在共栽培中形成3D球体。这表明肿瘤细胞形成3D球体与致癌突变的类型无关。尽管我们还没有测试其他类型的非黑色素瘤肿瘤细胞是否能够形成具有成纤维细胞的3D球形,但我们的发现表明,3D球形体的形成并不限于黑色素瘤细胞系,可能并不依赖于特定的癌细胞系。
我们展示了三维球形模型的两个实际应用示例。一个例子是阐明细胞内Notch信号通路活性,以调节癌症干细胞/起始细胞表型和3D球形形成。证明CAF的细胞内Notch信号通路是一种分子开关,利用该3D球形模型控制癌症干细胞/起始细胞的表型。我们的发现不仅揭示了癌症干细胞/起始细胞和癌症异质性基础的基质调控的分子机制,而且突出表明CAF中的Notch通路是黑色素瘤治疗的关键靶点。本示例表明,我们的 3D 球形模型对于研究癌细胞-基质成纤维细胞相互作用的机制和确定潜在的治疗靶点非常有用。另一个例子是在CAF的存在下测试癌症干细胞/起始细胞的药物反应。众所周知,癌细胞(包括癌症干细胞/起始细胞)的药物反应在CAF的存在和不存在时各不相同。这种体外系统中存在CAF,使该模型在临床上更相关,生成测试结果更可靠。此外,我们的 3D 球形系统是多功能的。它可用于各种目的。例如,如果在这个3D模型中使用了耐药癌细胞,它可以被改变以解决耐药性,也许肿瘤复发。它也可以修改,以测试或筛选药物,主要针对CAF的癌症治疗。CAF最近成为有前途的治疗目标。以 CAF 为目标有其优点。首先,与异常(通常具有基因改变)和智能(容易获得对化疗和放射治疗的抵抗力)的肿瘤细胞相比,肿瘤组织中的CAF是正常细胞,遗传更稳定,因此它们不太可能产生对治疗的抗药性。其次,针对CAF并不取决于肿瘤细胞的致癌突变的类型。第三,针对CAF可能通过成纤维细胞依赖性抗肿瘤、抗血管生成和/或调节癌症免疫反应实现多重打击效果。我们的 3D 球形模型是发现各种癌症治疗策略的有力工具。
The authors have nothing to disclose.
我们感谢Omaida C. Velazquez博士(迈阿密大学)的有益合作、协商和讨论;李杰博士(迈阿密大学)提供MeWo细胞;和米恩哈德·赫林博士(威斯塔研究所)提供所有其他黑色素瘤细胞。我们还感谢迈阿密大学分析成像核心设施主任Marcia Boulina博士的成像分析。刘兆军得到了银行头-科利癌症研究计划(第09BN-11奖)、妇女癌症协会(第53届年度赠款)和迈阿密大学内部基金的资助。
0.25% Trypsin-EDTA | Corning | 25-253-CI | |
24-well plate | Corning | 351147 | Non-tissue culture treated plate, 24-well, flat bottom with low evaporation lid |
Alex Fluor 488 goat anti-mouse IgG | Life Technology | A21202 | |
CaCl2 1.5 M | Sigma-Aldrich | C5670-500G | |
Collagenase, Type 1A | Sigma-Aldrich | C-2674 | 500 mg, 1 mg/mL concentration in DMEM. |
DakoCytomation | Dako | x0909 | |
DAPI | |||
Dispase Grade II | Roche Diagnostics | 165859 | |
Dulbecco's Modified Eagle's Medium(DMEM) | Corning | 10-013-CV | |
Fetal Bovine Serum | VMR | 97068-085 | Premium Grade |
Fiji (ImageJ) | NIH | Free for downloading, no license needed. | |
IncuCyte Zoom 2016A | Essen Bioscience | ||
IncuCyte Zoom System | Essen Bioscience | ||
Insulin | Sigma-Aldrich | I1882 | |
L-15 Medium (Leibovitz) | Sigma-Aldrich | L1518 | |
Leica SP5 Inverted Confocal Microscope | Leica | ||
MCDB 153 Medium | Sigma-Aldrich | M7403-10X1L | |
Mouse anti α-SMA (smooth muscle actin), monoclone | Abcam | ab18640 | |
Olympus IX51 Inverted Fluorescence Microscope | Olympus | IX51 | |
Olymupus CellSens | Olympus | ||
PD0325901 | Selleckchem Chemicals | S1036 | |
Penicillin Streptomycin Solution | Corning | 30-002- CI | 100 X |
Sodium Bicarbonate 7.5% | Corning | 25-035-CI |