يتم تأسيس نموذج كروي ثلاثي الأبعاد جديد يستند إلى التفاعل الهيتيريبيك من الخلايا السرطانية والخلايا الليفية المترالية. هنا ، نقدم الاستزراع المشترك للخلايا السرطانية والخلايا الليفية المترفية ، والتصوير الفاصل الزمني ، والمجهر المعالبؤر لتصور تشكيل الكرويدات. هذا النموذج ثلاثي الأبعاد يوفر منصة ذات الصلة لدراسة التفاعلات الورم ستروما واختبار علاجات السرطان.
تلعب تفاعلات الورم وستروما دورًا مهمًا في تطور السرطان. نماذج الورم ثلاثيالأبعاد (3D) الكروية هي النموذج الأكثر استخداما في المختبر في دراسة سرطان الجذعية / الخلايا البادئة، وبحوث السرطان قبل السريرية، وفحص المخدرات. النماذج الكروية ثلاثية الأبعاد متفوقة على ثقافة خلايا الورم التقليدية وتتكاثر بعض الشخصيات الهامة للأورام الصلبة الحقيقية. ومع ذلك ، تتكون كرويدات الورم ثلاثية الأبعاد التقليدية حصريًا من الخلايا السرطانية. أنها تفتقر إلى مشاركة الخلايا الترمفية ولديها ما يكفي من المصفوفة خارج الخلية (ECM) ترسب, وبالتالي تحاكي جزئيا فقط في ظروف الجسم الحي من أنسجة الورم. أنشأنا نموذج جديد متعدد الخلايا كروية 3D تتألف من الخلايا السرطانية والخلايا الليفية سترومال الذي يحاكي أفضل في البيئة الدقيقة الورم غير المتجانسة وdesmoplasia الأصلي. يتم تنظيم تشكيل الكرويدات بشكل صارم من قبل الخلايا الليفية المترفية الورم ية ويتم تحديدها من خلال نشاط بعض مسارات الإشارات الحاسمة داخل الخلايا (على سبيل المثال ، إشارات الشق) في الخلايا الليفية المترالية. في هذه المقالة ، نقدم تقنيات الزراعة المشتركة للخلايا السرطانية الليفية المترفية ، والتصوير الفاصل الزمني لتصور تفاعلات الخلية ، والمجهر المعالبؤر لعرض الميزات المعمارية ثلاثية الأبعاد للكرويدات. نعرض أيضا مثالين للتطبيق العملي لهذا النموذج كروي 3D. هذا النموذج الجديد متعدد الخلايا كروية 3D يقدم منصة مفيدة لدراسة التفاعل الورم ستروما, توضيح كيفية الخلايا الليفية سترومال تنظيم سرطان الجذعية / الخلايا البادئة, التي تحدد تطور الورم والعدوانية, واستكشاف تورط رد فعل سترومال في حساسية المخدرات السرطان والمقاومة. ويمكن لهذه المنصة أيضا أن تكون نموذجا في المختبر لاكتشاف المخدرات.
تمثل الأورام الصلبة الأنسجة المعقدة المكونة من خلايا الأورام وتشكيلة كبيرة من الخلايا المترالية1،2،3،4. الخلايا الليفية المترالية، أو الخلايا الليفية المرتبطة بالسرطان (CAF)، هي واحدة من مجموعات الخلايا المترالية البارزة في معظم أنواع الأورام الصلبة. وهم يشاركون بشكل حاسم في تنظيم نمو الورم، الجذعية، الانبثاث، تولد الأوعية، ومقاومة الأدوية من خلال إنتاج عوامل النمو، السيتوكينات / chemokines، توليف ECM وإعادة عرض الإنزيمات (على سبيل المثال، الكولاجين، ليفينكتين، ومصفوفة metalloproteases)، والإفراج عن exosomes، والتفاعل المباشر خلية heterotypic5،6،7،8،9،10،11 . CAF أيضا المشاركة في تحديد الانبثاث الجهاز السرطان يُحدد عن طريق التحديد المسبق مجموعة فرعية من المستنسخين الورم من مجموعات خلايا الورم غير متجانسة في الآفة الأولية وتعزيز هذه المستنسخات المختارة لتكون مهيأة للانبثاث إلى جهاز بعيد محدد بيئة دقيقة هو الأمثل لإعادة استعمار استنساخ مختارة12. وعلاوة على ذلك، الخلايا الليفية والعوامل القابلة للذوبان يفرز وECM المشاركة في تعديل تولد الأوعية الورم13،14،المضادة للورم الاستجابة المناعية15،وتشارك حتى في مقاومة المخدرات وتكرار الورم16،17.
في المختبر 3D نماذج الورم كرويتم تطويرها واستخدامها في أبحاث السرطان كنموذج وسيط بين الخلايا السرطانية في المختبر وفي نماذج الورم في الجسم الحي18،19،20،21. اكتسبت نماذج الورم ثلاثي الأبعاد شعبية في أبحاث الخلايا الجذعية السرطانية ، وأبحاث السرطان قبل السريرية ، وفحص الأدوية لأن هذه النماذج تستنسخ بعض الميزات الهامة للأورام الحقيقية التي لا توجد في الطبقات الأحادية التقليدية2D 22. العديد من النماذج الموجودة 3D الورم كرويتشكل فقط من الخلايا السرطانية وتفتقر إلى مشاركة الخلايا السرطانية. وهذا غالبا ما يؤدي إلى ورم كرويات وجود ترسب ECM غير كافية وعدم وجود تفاعلات الخلايا الهيتيريبيك. قد تكون الكرويدات ثلاثية الأبعاد التقليدية التي تشكلها الخلايا السرطانية والتصاق الخلايا المتجانسة جزئيًا فقط في ظروف أنسجة الورم في الجسم الحي. للتغلب على بعض هذه القيود، اقترح المحققون دمج أنواع متعددة من الخلايا السترومال في الثقافات المشتركة 3D وطوروا العديد من نماذج الورم ثلاثي الأبعاد ثلاثي ة الأبعاد23،24،25،26. وبالإضافة إلى ذلك، استخدم المحققون مصفوفات ثلاثية الأبعاد خارجية، بما في ذلك الهيدروجيلات الطبيعية أوالبوليمرات الاصطناعية مثل غليكول البولي إيثيلين، والبولي (لاكتيد- كو-جليكوليد)، وبولي (N-isopropylacrylamide)، لتضمين نماذج كروية أحادية الخلية ومتعددةالخلايا،وخلق بيئة داعمة للخلايا وإعادة إنتاج التفاعلات الخلية مصفوفة28،29،مما يجعل هذه النظم أكثر أهمية بيولوجيا. ومع ذلك ، فإن دمج أنواع معينة من الخلايا السترومال ، مثل الخلايا البطانية ، في الثقافات المشتركة ثلاثية الأبعاد يجلب تعقيدًا إضافيًا لنظام المختبر ويجعل من الصعب دراسة تفاعلات الخلايا الهيتيرية بين نوعين محددين من الخلايا ، مثل تفاعلات الخلايا الليفية السرطانية. وعلاوة على ذلك، الخلايا البطانة في الأنسجة الحقيقية لا تتفاعل دائما مباشرة مع الخلايا السرطانية وغيرها من الخلايا سترومال لأن هناك طبقة من غشاء الطابق السفلي ملفوفة خارج الشعيرات الدموية التي تمنع الخلايا البطانة من التفاعل مباشرة مع الخلايا السرطانية وغيرها من الخلايا السترومال. في تلك النماذج الكروية ثلاثية الأبعاد ، لا تشكل الخلايا البُنالتية المدمجة في الواقع أوعية دموية ، ولكنها تتفاعل مباشرة مع الخلايا السرطانية والخلايا السترومالية الأخرى ، وهو أمر نادر الحدوث في الجسم الحي. وبالمثل، فإن المصفوفات الخارجية المستخدمة في بعض النماذج الكروية ثلاثية الأبعاد ليست مطابقة لـ ECM في أنسجة الورم الحقيقية من حيث الهيكل والتكوين. كل هذه الشروط الاصطناعية قد تؤدي إلى بيانات مضللة.
لقد أنشأنا مؤخرًا نموذجًا كرويًا ثلاثي الخلايا متعدد الخلايا يتكون من الخلايا السرطانية وCAF. في نموذجنا ، يتم تحديد تكوين كرويدات الورم ثلاثية الأبعاد تمامًا من قبل CAF. CAF حث وتنظيم النمط الظاهري للورم الجذعية / الخلايا البادئة. وECM التي تنتجها CAF أمر طبيعي ويسمح للهيكل desmoplastic لمحاكاة أفضل في البيئة الدقيقة الورم الحي. هذا النموذج 3D الرواية يمكن أن تكون أداة مفيدة لفحص المخدرات السرطان ويقدم منصة فريدة من نوعها لدراسة التفاعل الورم ستروما، وتوضيح كيفية CAF تنظيم السرطان الجذعية / الخلايا البادئة، واستكشاف المشاركة في التفاعلات سترومال في حساسية المخدرات السرطان والمقاومة.
في المختبر 3D تقنيات زراعة الخلايا وقد استخدمت على نطاق واسع لعقود في أبحاث السرطان. بالمقارنة مع أنظمة زراعة الخلايا 2D التقليدية ، فإن البيئة الدقيقة ثلاثية الأبعاد تُلخص التفاعلات بين الخلية و / أو مصفوفة الخلية وتمكن من محاكاة الحالات الحقيقية التي لوحظت في أنسجة الورم. ومع ذلك ، فإن نظام 3D التي شكلتها فقط من الخلايا السرطانية والتفاعلات الخلايا المتجانسة الخلايا لا تأخذ في الاعتبار أهمية الكلام عبر heterotypic ويمكن أن توفر نتائج غير دقيقة في البحوث. لقد قمنا مؤخرًا بتطوير نظام جديد ثلاثي الأبعاد يجمع بين الخلايا السرطانية وCAF لمحاكاة أفضل في البيئة الدقيقة للورم غير المتجانسة ورد فعله الأصلي والقاسي.
الخلايا الليفية هي المكونات الرئيسية للورم ستروما. وتشارك CAF في تنظيم تطور الورم عن طريق إثارة العوامل القابلة للذوبان، ECM / إعادة عرض الإنزيمات10،11،وexosomes. بالإضافة إلى ذلك، يلعب CAF دورا في مقاومة الأدوية وتكرار الورم16،17. يمكن استخدام نظامنا ثلاثي الأبعاد ثلاثي الخلايا لاستكشاف الآليات الجزيئية للتفاعلات بين الورم والورم ومعالجة مقاومة الأدوية وتكرار الورم. وتستمد في المقام الأول CAF من الخلايا الليفية المحلية تنشيط هادئة وتجنيد تعميم نخاع العظام MSC، والتي تخضع في الموقع التمايز إلى CAF في أنسجة الورم37،38،39. في الدراسة الحالية، استخدمنا الخلايا الليفية الجلدية لإنشاء نموذج كروي ثلاثي الأبعاد متعدد الخلايا. ومع ذلك ، فإن نوعًا آخر من الخلايا الليفية (على سبيل المثال ، MSC-DF) ، يعمل أيضًا بطريقة مشابهة جدًا للخلايا الليفية الجلدية لتنظيم تكوين الخلية السرطانية ثلاثية الأبعاد34. يمكن أن تولد MSC-DF من نخاع العظم المورين MSC، الذي يتم تخصيبه عن طريق زراعة نخاع العظم الخلايا أحادية النواة في وسط ثقافة الخلايا MSC لمدة 10 أيام مع تغييرات متوسطة دورية كل 3 أيام. وتتميز هذه MSC كما CD73+/ CD105+/ لين–. للتمييز MSC إلى الخلايا الليفية، يتم استزراع MSC لاحقًا مع DMEM كاملة لمدة أسبوعين إضافيين. تتميز MSC-DF بأنها α-SMA+/ Vimentin+/FSP-1+ الخلايا36. يمكن أن يكون MSC-DF منظم الأورام المهم. لأن يتم تمييز جزء صغير من CAF في العديد من أنواع الأورام الصلبة من المعينين تعميم MSC صدر من نخاع العظام36، MSC-DF يمكن أن تكون أهدافا العلاج واعدة. كما أنها أكثر سهولة من حيث التلاعب أو المستهدفة علاجيا قبل أن يتم تجنيدهم لأنسجة الورم وتمييزها في CAF. وهكذا، لدينا نموذج 3D يقدم نظام مثالي لدراسة واختبار ليس فقط الخلايا السرطانية، ولكن أيضا كسور مختلفة أو مجموعات فرعية من CAF. طريقة تشكيل كروية ثلاثية الأبعاد واضحة. وتشمل الخطوات الحاسمة استخدام وسيط مصل حر للاستزراع المشترك، وتطبيق النسبة الصحيحة من الخلايا الليفية إلى الخلايا السرطانية، واستخدام لوحات الثقافة الصحيحة للاستزراع المشترك. القيد المحتمل لطريقتنا هو أن تشكيل كرويدات ثلاثية الأبعاد يعتمد إلى حد كبير على خط الخلايا السرطانية. قد يتطلب بروتوكول تشكيل كروي ة لدينا تحسين النسبة بين الخلايا الليفية والخلايا السرطانية إذا تم استخدام خطوط خلايا سرطانية مختلفة. تجدر الإشارة إلى أننا استخدمنا خلية الميلانوما البشرية ونموذج الاستزراع المشترك للخلايا الليفية للفأر لتشكيل كرويدات ثلاثية الأبعاد ، لأنه من الأسهل بكثير إنشاء خلايا GOF أو LOF في الخلايا الليفية للفأر لدراسة دور جزيء أو مسار إشارة في تنظيم تكوين الورم الكروي. تشير قدرة خلايا الورم الميلانيني البشري والخلايا الليفية للفئران على تشكيل الخلايا الكروية إلى أن الجزيئات المطلوبة للاتصالات بين الخلايا تعمل عبر الأنواع. لقد اختبرنا مؤخرا الاستزراع المشترك للانفجارات الليفية البشرية مع خلايا الورم الميلانيني البشري ووجدنا أن الخلايا الليفية البشرية يمكن أن تنظم أيضًا خلايا الورم الميلانيني البشري لتشكيل كرويدات ثلاثية الأبعاد.
لقد وظفنا خلايا الورم الميلانيني النقيلي البشري، C8161، في نموذجنا ثلاثي الأبعاد متعدد الخلايا. كما اختبرنا خلايا سرطان الجلد البشرية الأخرى، على سبيل المثال، 1205Lu32، الذي يحمل طفرة BRAFV600E، وMeWo، الذي يعبر عن مستويات عالية من CDK4/Kit (ATCC HTB-65)، ووجدت أنها قادرة أيضا على تشكيل كرويدات ثلاثية الأبعاد في الثقافة المشتركة. وهذا يشير إلى أن تشكيل كرويدات ثلاثية الأبعاد بواسطة الخلايا السرطانية مستقلة عن أنواع الطفرات الأورامية. على الرغم من أننا لم نختبر ما إذا كانت الأنواع الأخرى من الخلايا السرطانية غير الميلانوما قادرة على تشكيل كرويدات ثلاثية الأبعاد مع الخلايا الليفية ، تشير النتائج التي توصلنا إليها إلى أن تكوين كرويدات ثلاثية الأبعاد لا يقتصر على خط خلايا سرطانية وقد لا يعتمد على خط خلايا سرطاني محدد.
أظهرنا مثالين من التطبيقات العملية لنموذجنا كروي 3D. كان أحد الأمثلة على توضيح نشاط مسار الإشارة داخل الخلايا Notch في تنظيم النمط الظاهري للخلايا الجذعية / البادئة السرطان وتشكيل كروي ثلاثي الأبعاد. لقد أثبتنا أن مسار الإشارات داخل الخلايا Notch في CAF هو مفتاح جزيئي يتحكم في النمط الظاهري للخلايا الجذعية / البادئة بالسرطان باستخدام هذا النموذج الكروي ثلاثي الأبعاد. النتائج التي توصلنا إليها ليس فقط الكشف عن آلية الجزيئية الكامنة وراء تنظيم سترومال من السرطان الجذعية / الخلايا البادئة وheterogenicity السرطان، ولكن أيضا تسليط الضوء على أن مسار نوتش في CAF هو هدف حاسم لعلاجات سرطان الجلد. يشير هذا المثال إلى أن نموذجنا الكروي ثلاثي الأبعاد مفيد جدًا لدراسة آليات تفاعلات الخلايا الليفية التليفائية التليفائية السرطانية وتحديد الأهداف العلاجية المحتملة. مثال آخر هو اختبار استجابة الدواء من السرطان الجذعية / الخلايا البادئة في وجود CAF. ومن المعروف جيدا أن استجابة المخدرات من الخلايا السرطانية، بما في ذلك سرطان الجذعية / الخلايا البادئة، يختلف في وجود وعدم وجود CAF. وجود CAF في هذا النظام المختبري يجعل هذا النموذج أكثر ملاءمة سريريا ونتائج الاختبار ولدت أكثر موثوقية. وعلاوة على ذلك، لدينا نظام كروي ثلاثي الأبعاد هو تنوعا. ويمكن استخدامه لأغراض مختلفة. على سبيل المثال، إذا تم استخدام الخلايا السرطانية المقاومة للأدوية في هذا النموذج ثلاثي الأبعاد، يمكن تغييره لمعالجة مقاومة الأدوية وربما تكرار الورم. ويمكن أيضا أن يتم تعديلها لاختبار أو فحص الأدوية التي تستهدف في المقام الأول CAF لعلاج السرطان. وقد أصبحت الكاف مؤخرا أهدافا علاجية واعدة. هناك مزايا لاستهداف CAF. أولاً، بالمقارنة مع الخلايا السرطانية غير الطبيعية (غالباً مع التعديلات الوراثية) والذكية (بسهولة كسب مقاومة للعلاج الكيميائي والإشعاعي)، CAF في الأنسجة السرطانية هي خلايا طبيعية وأكثر استقراراً وراثياً، لذلك هم أقل عرضة لتطوير مقاومة للعلاجات. ثانياً، لا يعتمد استهداف CAF على نوع الطفرات الأورامية في الخلايا السرطانية. ثالثاً، قد يحقق استهداف CAF تأثيرات إصابة متعددة من خلال مضادات الورم التي تعتمد على الخلايا الليفية، والتكوين المضاد للأنجيوعية، و/أو الاستجابة المناعية للسرطان المغيرة. نموذجنا الكروي ثلاثي الأبعاد هو أداة قوية لاكتشاف مجموعات متنوعة من الاستراتيجيات العلاجية للسرطان.
The authors have nothing to disclose.
نشكر الدكتورة أوميدا سي فيلاسكيز (جامعة ميامي) على التعاون والمشاورات والمناقشة المفيدة؛ الدكتور جي لي (جامعة ميامي) لتوفير خلايا MeWo؛ والدكتور ميهادر هيرلين (معهد ويستار) لتوفير جميع خلايا الورم الميلانيني الأخرى. كما نشكر الدكتورة مارسيا بولينا، مديرة مرفق التصوير التحليلي الأساسي، جامعة ميامي، على تحليل التصوير. تم دعم تشاو جون ليو بمنح من برنامج أبحاث السرطان Bankhead-Coley (جائزة 09BN-11) وجمعية سرطان المرأة (المنحة السنوية53) والأموال الداخلية من جامعة ميامي.
0.25% Trypsin-EDTA | Corning | 25-253-CI | |
24-well plate | Corning | 351147 | Non-tissue culture treated plate, 24-well, flat bottom with low evaporation lid |
Alex Fluor 488 goat anti-mouse IgG | Life Technology | A21202 | |
CaCl2 1.5 M | Sigma-Aldrich | C5670-500G | |
Collagenase, Type 1A | Sigma-Aldrich | C-2674 | 500 mg, 1 mg/mL concentration in DMEM. |
DakoCytomation | Dako | x0909 | |
DAPI | |||
Dispase Grade II | Roche Diagnostics | 165859 | |
Dulbecco's Modified Eagle's Medium(DMEM) | Corning | 10-013-CV | |
Fetal Bovine Serum | VMR | 97068-085 | Premium Grade |
Fiji (ImageJ) | NIH | Free for downloading, no license needed. | |
IncuCyte Zoom 2016A | Essen Bioscience | ||
IncuCyte Zoom System | Essen Bioscience | ||
Insulin | Sigma-Aldrich | I1882 | |
L-15 Medium (Leibovitz) | Sigma-Aldrich | L1518 | |
Leica SP5 Inverted Confocal Microscope | Leica | ||
MCDB 153 Medium | Sigma-Aldrich | M7403-10X1L | |
Mouse anti α-SMA (smooth muscle actin), monoclone | Abcam | ab18640 | |
Olympus IX51 Inverted Fluorescence Microscope | Olympus | IX51 | |
Olymupus CellSens | Olympus | ||
PD0325901 | Selleckchem Chemicals | S1036 | |
Penicillin Streptomycin Solution | Corning | 30-002- CI | 100 X |
Sodium Bicarbonate 7.5% | Corning | 25-035-CI |