Özet

Verwendung von Alu-Element enthaltenden Minigenes zur Analyse von kreisförmigen RNAs

Published: March 10, 2020
doi:

Özet

Wir klonen und analysieren Reportergene, die kreisförmige RNAs erzeugen. Diese Reportergene sind größer als Konstrukte, um lineare Spleißungen zu analysieren und Alu-Elemente zu enthalten. Zur Untersuchung der kreisförmigen RNAs werden die Konstrukte in Zellen transfiziert und die resultierende RNA wird mit RT-PCR nach Entfernung linearer RNA analysiert.

Abstract

Neben linearen mRNAs erzeugen viele eukaryotische Gene kreisförmige RNAs. Die meisten kreisförmigen RNAs werden generiert, indem eine 5′ Spleißstelle mit einer vorgelagerten 3′ Spleißstelle innerhalb einer Pre-mRNA, einem Prozess, der als Back-Spleicing bezeichnet wird, angeschlossen wird. Diese Zirkularisierung wird wahrscheinlich durch sekundäre Strukturen in der Pre-mRNA unterstützt, die die Spleißstellen in die Nähe bringen. In menschlichen Genen werden Alu-Elemente gedacht, um diese sekundären RNA-Strukturen zu fördern, da Alu-Elemente reichlich vorhanden sind und Basiskomplementaritäten miteinander aufweisen, wenn sie in entgegengesetzten Richtungen in der Pre-mRNA vorhanden sind. Hier beschreiben wir die Erzeugung und Analyse großer Alu-Elemente, die Reportergene enthalten, die kreisförmige RNAs bilden. Durch die Optimierung von Klonprotokollen können Reportergene mit bis zu 20 kb Insert-Länge erzeugt werden. Ihre Analyse in Co-Transfektionsexperimenten ermöglicht die Identifizierung regulatorischer Faktoren. So kann diese Methode RNA-Sequenzen und zelluläre Komponenten identifizieren, die an der kreisförmigen RNA-Bildung beteiligt sind.

Introduction

Zirkuläre RNAs
Circular RNAs (circRNAs) sind kovalent geschlossene einsträngige RNAs, die in den meisten Organismen exprimiert werden. Sie werden erzeugt, indem sie eine nachgelagerte 5′ Spleißstelle zu einem vorgelagerten 3′ Spleißstandort verbinden, ein Prozess, der als Back-Spleicing bezeichnet wird (Abbildung 1A)1. Sequenzen in der Pre-mRNA, die eine Basis komplementär wie 30-40 nt aufweisen, bringen Back-Splice-Sites in die richtige Ausrichtung für die zirkRNA-Bildung2. Beim Menschen bilden Alu-Elemente 1, die etwa 11% des Genoms3darstellen, aufgrund ihrer Selbstkomplementärität4,5 umfangreiche doppelsträngige RNA-Strukturen in pre-mRNA und fördern damit die Bildung von CircRNAs1.

Derzeit wurden drei Hauptfunktionen von circRNAs beschrieben. Einige circRNAs binden microRNAs (miRNAs) und wirken durch Sequestrierung wie miRNA Schwämme6. CircRNAs wurden in die transkriptionelle und posttranskriptionelle Regulierung, durch Wettbewerb mit linearer Spleißung7 oder Modulation der Transkriptionsfaktoraktivität8verwickelt. Schließlich enthalten circRNAs kurze offene Leserahmen und Grundsatzstudien zeigen, dass sie9,10übersetzt werden können. Die Funktion der meisten circRNAs bleibt jedoch rätselhaft. Die meisten zirkulären RNAs wurden mit den Sequenzierungsmethoden der nächsten Generation11erkannt. Detaillierte Analysen einzelner Gene mit gezielten RT-PCR-Ansätzen zeigen, dass eine große Anzahl von kreisförmigen RNAs noch entdeckt werden muss12.

Einsatz von Reportergenen zur Analyse der Pre-mRNA-Verarbeitung
Die Analyse von mRNA, die von DNA-Reporterkonstrukten abgeleitet wurde, die in Zellen transfiziert werden, ist eine etablierte Methode zur Untersuchung alternativer Pre-mRNA-Spleißungen, die auf kreisförmige RNAs angewendet werden können. Im Allgemeinen werden das alternative Exon, seine umgebenden Introns und konstitutive Exons verstärkt und zu einem eukaryotischen Expressionsvektor geklont. Häufig werden die Introns verkürzt. Die Konstrukte werden in eukaryotische Zellen transfiziert und in der Regel von RT-PCR13,14analysiert. Dieser Ansatz wurde ausgiebig verwendet, um regulatorische Spleißstellen und transacting Faktoren in Co-Transfektionsexperimenten13,15,16,17,18zu kartieren. Darüber hinaus ermöglichte die Erzeugung von proteinexstigen Minigenen das Screening von Substanzen, die alternative Spleißen ändern19,20.

Die Methode wurde auf zirkuläre RNAs angewendet. Derzeit sind mindestens 12 Minigen-Rückgrate in der Literatur beschrieben und in Tabelle 1zusammengefasst. Mit Ausnahme des tRNA-basierten Expressionssystems21,22sind sie alle von Polymerase-II-Promotoren abhängig. Hier beschreiben wir eine Methode zur Generierung menschlicher Reporter-Minigene, um cis und trans-acting Faktoren zu bestimmen, die an der Erzeugung von kreisförmigen RNAs beteiligt sind. Eine Übersicht über die Methode anhand von Sequenzen eines veröffentlichten Reportergens23 ist in Abbildung 1dargestellt.

Protocol

1. Konstruktion der Konstrukte Verwenden Sie den UCSC-Genombrowser24, um sich wiederholende Elemente zu identifizieren, die für die kreisförmige RNA-Bildung erforderlich sind, und integrieren Sie sie in die Konstrukte. Wichtig ist, dass Primer für die Verstärkung außerhalb der sich wiederholenden Elemente liegen müssen. Fügen Sie die kreisförmige RNA-Sequenz(Supplemental Abbildung 1 ist eine Testsequenz) in <a href="https://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgBla…

Representative Results

Reportergene ermöglichen die Bestimmung regulatorischer Faktoren, die die zirkuläre RNA-Bildung beeinflussen. Diese Reportergene sind jedoch groß und enthalten sich wiederholende Elemente, die DNA-Konstrukte oft instabil machen. Aufgrund ihrer großen Größe ist es oft notwendig, Teile der Introns zu löschen, was durch die Verstärkung genomischer Teile mit den Exons und kleineren flankierenden intronischen Teilen erreicht wird. Diese DNA-Stücke werden enzymatisch zusammengesetzt, so dass Enzyme ohne Einschränkung…

Discussion

Im Allgemeinen sind kreisförmige RNAs niedrig reichlich1, was die Untersuchung ihrer Funktion und Bildung erschwert. Ähnlich wie bei linearen RNAs13ermöglicht die Verwendung von Reporter-Minigenes die Identifizierung von cis und trans-wirkenden Faktoren, die die Bildung von kreisförmigen RNAs regulieren. So erzeugt dieser Ansatz Hypothesen, die mit den endogene Genen weiter getestet werden können.

Der wichtigste Schritt ist das Design des Re…

Açıklamalar

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Diese Arbeit wurde vom DoD-Zuschuss des Verteidigungsministeriums AZ180075 unterstützt. Stefan Stamm dankt Jacqueline Noonan Endowment. Unterstützt wurde Anna Pawluchin vom DAAD, dem deutschen akademischen Austauschprogramm, Justin R. Welden erhielt den Max Steckler Award der University of Kentucky.

Materials

(PEI) Hydrochloride Polysciences 24765-1
Builder tool NEB https://nebuilder.neb.com/#!/
Dark Reader Transilluminator. Clare Chemical Research
Enzymatic DNA assembly kit NEB E2621S
Gel and PCR cleanup kit Promega A9282
Glyco Blue Thermo Fisher AM9516
pcDNA3.1 cloning site Polycloning site https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LSG/manuals/pcdna3_1_man.pdf
Polymerase 1 NEB M0491L Q5 DNA polymerase
Polymerase 2 Biorad 1725310 Long range polymerase (NEB), iproof (BioRad)
Polymerase 2 Qiagen 206402 Qiagen long range polymerase kit
Reverse Transcriptase Thermo Fisher 18080044
RNA isolation kit Life Technologies 12183025 Ambion by Life Technologies
RNAse R Lucigen RNR07250 Epicenter/Lucigen
Stable competent cells NEB C3040H NEB stable cells
Standard cloning bacteria NEB C2988J NEB5-alpha competent
Web tool to design primers NEB https://nebuilder.neb.com/#!/
Web-based temperature calculations NEB https://tmcalculator.neb.com/#!/main

Referanslar

  1. Jeck, W. R., et al. Circular RNAs are abundant, conserved, and associated with ALU repeats. RNA. 19 (2), 141-157 (2013).
  2. Zhang, X. O., et al. Complementary sequence-mediated exon circularization. Cell. 159 (1), 134-147 (2014).
  3. Deininger, P. Alu elements: know the SINEs. Genome Biology. 12 (12), 236 (2011).
  4. Bazak, L., Levanon, E. Y., Eisenberg, E. Genome-wide analysis of Alu editability. Nucleic Acids Research. 42 (11), 6876-6884 (2014).
  5. Levanon, E. Y., et al. Systematic identification of abundant A-to-I editing sites in the human transcriptome. Nature Biotechnology. 22 (8), 1001-1005 (2004).
  6. Hansen, T. B., et al. Natural RNA circles function as efficient microRNA sponges. Nature. 495 (7441), 384-388 (2013).
  7. Kelly, S., Greenman, C., Cook, P. R., Papantonis, A. Exon Skipping Is Correlated with Exon Circularization. Journal of Molecular Biology. 427 (15), 2414-2417 (2015).
  8. Li, Z., et al. Exon-intron circular RNAs regulate transcription in the nucleus. Nature Structural & Molecular Biology. 22 (3), 256-264 (2015).
  9. Yang, Y., et al. Extensive translation of circular RNAs driven by N(6)-methyladenosine. Cell Research. 27 (6), 626-641 (2017).
  10. Abe, N., et al. Rolling Circle Translation of Circular RNA in Living Human Cells. Scientific Reports. 5, 16435 (2015).
  11. Salzman, J., Chen, R. E., Olsen, M. N., Wang, P. L., Brown, P. O. Cell-type specific features of circular RNA expression. PLOS Genetics. 9 (9), 1003777 (2013).
  12. Ottesen, E. W., Luo, D., Seo, J., Singh, N. N., Singh, R. N. Human Survival Motor Neuron genes generate a vast repertoire of circular RNAs. Nucleic Acids Research. 47 (6), 2884-2905 (2019).
  13. Stoss, O., Stoilov, P., Hartmann, A. M., Nayler, O., Stamm, S. The in vivo minigene approach to analyze tissue-specific splicing. Brain Research Protocols. 4, 383-394 (1999).
  14. Mardon, H. J., Sebastio, G., Baralle, F. E. A role for exon sequences in alternative splicing of the human fibronectin gene. Nucleic Acids Research. 15, 7725-7733 (1987).
  15. Gaildrat, P., et al. Use of splicing reporter minigene assay to evaluate the effect on splicing of unclassified genetic variants. Methods in Molecular Biology. 653, 249-257 (2010).
  16. Cooper, T. A. Use of minigene systems to dissect alternative splicing elements. Methods. 37 (4), 331-340 (2005).
  17. Baralle, D., Baralle, M. Splicing in action: assessing disease causing sequence changes. Journal of Medical Genetics. 42 (10), 737-748 (2005).
  18. Percifield, R., Murphy, D., Stoilov, P. Medium throughput analysis of alternative splicing by fluorescently labeled RT-PCR. Methods in Molecular Biology. 1126, 299-313 (2014).
  19. Stoilov, P., Lin, C. H., Damoiseaux, R., Nikolic, J., Black, D. L. A high-throughput screening strategy identifies cardiotonic steroids as alternative splicing modulators. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (32), 11218-11223 (2008).
  20. Shen, M., et al. Pyrvinium pamoate changes alternative splicing of the serotonin receptor 2C by influencing its RNA structure. Nucleic Acids Research. 41 (6), 3819-3832 (2013).
  21. Noto, J. J., Schmidt, C. A., Matera, A. G. Engineering and expressing circular RNAs via tRNA splicing. RNA Biology. , 1-7 (2017).
  22. Schmidt, C. A., Noto, J. J., Filonov, G. S., Matera, A. G. A Method for Expressing and Imaging Abundant, Stable, Circular RNAs In Vivo Using tRNA Splicing. Methods in Enzymology. 572, 215-236 (2016).
  23. Welden, J. R., van Doorn, J., Nelson, P. T., Stamm, S. The human MAPT locus generates circular RNAs. Biochimica et Biophysica Acta – Molecular Basis of Disease. , 2753-2760 (2018).
  24. Casper, J., et al. The UCSC Genome Browser database: 2018 update. Nucleic Acids Research. 46, 762-769 (2018).
  25. Grozdanov, P. N., MacDonald, C. C. Generation of plasmid vectors expressing FLAG-tagged proteins under the regulation of human elongation factor-1alpha promoter using Gibson assembly. Journal of Visualized Experiments. (96), (2015).
  26. Wang, Y., et al. A novel strategy to engineer DNA polymerases for enhanced processivity and improved performance in vitro. Nucleic Acids Research. 32 (3), 1197-1207 (2004).
  27. Gibson, D. G., et al. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nature Methods. 6 (5), 343-345 (2009).
  28. Conn, S. J., et al. The RNA binding protein quaking regulates formation of circRNAs. Cell. 160 (6), 1125-1134 (2015).
  29. Jeck, W. R., Sharpless, N. E. Detecting and characterizing circular RNAs. Nature Biotechnology. 32 (5), 453-461 (2014).
  30. Pamudurti, N. R., et al. Translation of CircRNAs. Molecular Cell. 66 (1), 9-21 (2017).
  31. Kramer, M. C., et al. Combinatorial control of Drosophila circular RNA expression by intronic repeats, hnRNPs, and SR proteins. Genes & Development. 29 (20), 2168-2182 (2015).
  32. Starke, S., et al. Exon circularization requires canonical splice signals. Cell Reports. 10 (1), 103-111 (2015).
  33. Suzuki, H., Tsukahara, T. A view of pre-mRNA splicing from RNase R resistant RNAs. International Journal of Molecular Sciences. 15 (6), 9331-9342 (2014).
  34. Zhang, X. O., et al. Diverse alternative back-splicing and alternative splicing landscape of circular RNAs. Genome Research. 26 (9), 1277-1287 (2016).
  35. Liang, D., Wilusz, J. E. Short intronic repeat sequences facilitate circular RNA production. Genes & Development. 28 (20), 2233-2247 (2014).
  36. Wang, Y., Mandelkow, E. Tau in physiology and pathology. Nature Reviews Neuroscience. 17 (1), 5-21 (2016).
  37. Fejes-Toth, K., et al. Post-transcriptional processing generates a diversity of 5′-modified long and short RNAs. Nature. 457 (7232), 1028-1032 (2009).
  38. Gao, Q. S., et al. Complex regulation of tau exon 10, whose missplicing causes frontotemporal dementia. Journal of Neurochemistry. 74 (2), 490-500 (2000).
  39. Hartmann, A. M., et al. Regulation of alternative splicing of human tau exon 10 by phosphorylation of splicing factors. Molecular and Cellular Neuroscience. 18 (1), 80-90 (2001).
  40. Wang, Y., Wang, Z. Efficient backsplicing produces translatable circular mRNAs. RNA. 21 (2), 172-179 (2015).
  41. Yang, Y., Wang, Z. Constructing GFP-Based Reporter to Study Back Splicing and Translation of Circular RNA. Methods in Molecular Biology. 1724, 107-118 (2018).
  42. Zheng, Q., et al. Circular RNA profiling reveals an abundant circHIPK3 that regulates cell growth by sponging multiple miRNAs. Nature Communications. 7, 11215 (2016).
  43. Jia, W., Xu, B., Wu, J. Circular RNA expression profiles of mouse ovaries during postnatal development and the function of circular RNA epidermal growth factor receptor in granulosa cells. Metabolizma. 85, 192-204 (2018).
  44. Liang, D., et al. The Output of Protein-Coding Genes Shifts to Circular RNAs When the Pre-mRNA Processing Machinery Is Limiting. Molecular Cell. 68 (5), 940-954 (2017).
  45. Legnini, I., et al. Circ-ZNF609 Is a Circular RNA that Can Be Translated and Functions in Myogenesis. Molecular Cell. 66 (1), 22-37 (2017).
  46. Li, X., et al. Coordinated circRNA Biogenesis and Function with NF90/NF110 in Viral Infection. Molecular Cell. 67 (2), 214-227 (2017).
  47. Zhang, Y., et al. The Biogenesis of Nascent Circular RNAs. Cell Reports. 15 (3), 611-624 (2016).

Play Video

Bu Makaleden Alıntı Yapın
Welden, J. R., Pawluchin, A., van Doorn, J., Stamm, S. Use of Alu Element Containing Minigenes to Analyze Circular RNAs. J. Vis. Exp. (157), e59760, doi:10.3791/59760 (2020).

View Video