توليد الخلايا الجذعية العصبية المستحثة من الخلايا أحادية النووية الطرفية والتمايز نحو سلائف الخلايا العصبية الدوبامين لدراسات زرع

مرض باركنسون (PD) هو اضطراب عصبي شائع، الناجم عن انحطاط الخلايا العصبية الدوبامين (DA) في substantia nigra pars compacta (SNpc) في mesencephalon البطيني (VM)، مع انتشار أكثر من 1٪ في السكان الذين تزيد أعمارهم عن 60 عاما ^{1 , 2.}على مدى العقد الماضي، والعلاج الخلوي، تهدف إما إلى استبدال الخلايا التنكسية أو التالفة، أو تغذية البيئة الدقيقة حول الخلايا العصبية المتحللة، وقد أظهرت إمكانات في علاج PD³. وفي الوقت نفسه، حققت تكنولوجيا إعادة البرمجة تقدما كبيرا⁴، والذي يوفر مصدرا الخلوية واعدة للعلاج البديل. وقد ثبت أن الخلايا الجذعية المتعددة القوى التي يسببها الإنسان (iPSCs) والخلايا الجذعية الجنينية (ESCs) قادرة على التمييز في الخلايا العصبية DA، والتي يمكن أن البقاء على قيد الحياة، والنضج، وتحسين وظائف المحرك عند تطعيمها في نماذج PD الرئيسيات الفئران وغير البشرية^{5 ،6،7،8}. وتمثل هذه المراكز معلماً بارزاً في تكنولوجيات إعادة برمجة الخلايا ولها إمكانات كبيرة في مجال زرع الخلايا؛ ومع ذلك، لا يزال هناك قلق بشأن خطر تكوين الورم من الخلايا المتمايزة بشكل غير كامل. مصدر خلوي بديل لزراعة الخلايا هو الخلايا الجذعية البالغة الملتزمة بالسلالات التي يتم الحصول عليها من خلال إعادة البرمجة المباشرة، مثل الخلايا الجذعية العصبية المستحثة (iNSCs)، والتي يمكن اشتقاقها من الوسطاء غير المستقرين، متجاوزين القوى المتعددة المرحلة9،^10،11.

يمكن إعادة برمجة كل من iPSCs وiNSCs من المصادر الخلوية الذاتية، مثل الخلايا الليفية، والخلايا أحادية النووية في الدم المحيطي (PBMNCs) وأنواع أخرى مختلفة من الخلايا^12،13،14،مما يقلل من مناعة الخلايا المزروعة إلى حد كبير. وعلاوة على ذلك، بالمقارنة مع iPSCs، iNSCs هي متأصلة مع انخفاض خطر تشكيل الورم واللدونة الملتزمة النسب، قادرة فقط على التمييز في الخلايا العصبية وglia¹¹. في الدراسات الأولية، تم إنشاء iPSCs الإنسان أو الماوس وiNSCs من الخلايا الليفية التي تم الحصول عليها من الخزعات الجلدية، وهو إجراء الغازية^14،15. وفي هذا الصدد، فإن مركبات PBMNCs هي مصدر خلايا بداية جذاب بسبب عملية أخذ العينات الأقل تدخلاً، وسهولة الحصول على أعداد كبيرة من الخلايا في غضون فترة قصيرة من فترة التوسع¹⁶. استخدمت دراسات إعادة البرمجة الأولية أنظمة التسليم التكاملي، مثل ناقلات الفيروسات اللينة أو الفيروسات الرجعية، والتي هي فعالة وسهلة التنفيذ في العديد من أنواع الخلايا¹⁷؛ ومع ذلك، قد تسبب أنظمة التسليم هذه طفرات وإعادة تنشيط الجينات المتحولة المتبقية، والتي تقدم قضايا السلامة لأغراض العلاج السريري¹². فيروس سينداي (SeV) هو فيروس RNA غير تكاملي مع جينوم سلبي، واحد الذين تقطعت بهم السبل التي لا تندمج في الجينوم المضيف، ولكن يتكرر فقط في السيتوبلازم من الخلايا المصابة، وتقديم وسيلة فعالة وآمنة لإعادة برمجة^{18 ،19}. تتوفر متجهات SeV المؤتلفة التي تحتوي على عوامل إعادة برمجة بما في ذلك OCT3/4الإنسان، SOX2، KLF4 و c-MYC في إطارات القراءة المفتوحة الخاصة بهم. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن زيادة تحسين ناقلات الفيروس SeV عن طريق إدخال طفرات حساسة لدرجة الحرارة، بحيث يمكن إزالتها بسرعة عندما يتم رفع درجة حرارة الثقافة إلى 39 درجة مئوية²⁰. في هذه المقالة، نقوم بوصف بروتوكول لإعادة برمجة PBMNCs إلى iNSCs باستخدام نظام SeV.

وقد ذكرت العديد من الدراسات اشتقاق الخلايا العصبية DA من ESCs الإنسان أو iPSCs باستخدام أساليب مختلفة^6،8،21. ومع ذلك، هناك نقص في البروتوكولات التي تصف التمايز بين الخلايا العصبية DA من iNSCs في التفاصيل. في هذا البروتوكول، سوف نقوم بوصف الجيل الفعال من الخلايا العصبية DA من iNSCs باستخدام طريقة على مرحلتين. يمكن زرع السلائف العصبية DA في striatum من نماذج الماوس PD لتقييمات السلامة والفعالية. ستقدم هذه المقالة بروتوكول مفصل يغطي مراحل مختلفة من جيل الخلايا الجذعية العصبية المستحثة بفيروس سينداي، تمايز الـ iNSCs في الخلايا العصبية DA، وإنشاء نماذج PD الماوس، إلى زرع سلائف DA في السترياتوم من نماذج PD. باستخدام هذا البروتوكول، يمكن للمرء أن يولد iNSCs من المرضى والمانحين الأصحاء وتستمد الخلايا العصبية DA التي هي آمنة، قابلة للتوحيد القياسي، قابلة للتحجيم ومتجانسة لأغراض زرع الخلايا، أو لنمذجة PD في طبق والتحقيق في الآليات بداية المرض الكامنة والتنمية.