肿瘤微环境是癌症生长和侵袭的重要组成部分。为了模仿癌症的进展, 需要一个与生物学相关的人类基质。该方案介绍了应用人平滑肌瘤基基质进行体外三维球体入侵检测的改进。该协议还介绍了基于计算机的细胞入侵分析。
基于二维细胞培养的检测是体外癌症研究中常用的方法。然而, 它们缺乏形成肿瘤微环境的几个基本要素。为了获得更可靠的体外结果, 引入了几种三维 (3D) 细胞培养检测方法。这些检测允许癌细胞与细胞外基质相互作用。这种相互作用影响细胞行为, 如增殖和入侵, 以及细胞形态。此外, 这种相互作用可以诱导或抑制几个原蛋白和抗肿瘤分子的表达。建立了球体侵袭法, 为研究癌细胞浸润提供了合适的三维体外方法。目前, 动物源性基质, 如小鼠肉瘤衍生基质 (MSDM) 和大鼠尾 i 型胶原蛋白, 主要用于球体侵袭检测。考虑到人类肿瘤微环境与动物源性基质的差异, 从良性子宫平滑肌瘤组织中形成了人肌瘤衍生基质 (HMDM)。研究表明, HMDM 比 MSDM 能诱导癌细胞的迁移和侵袭。该协议提供了一种简单、可重复、可靠的基于人肿瘤的球状侵袭方法, 该方法采用了 Hmdm/纤维蛋白基质。它还包括有关成像和分析的详细说明。球体生长在一个 u 形的超低连接板在 Hmdm/纤维蛋白矩阵内, 并通过它入侵。每天使用 ilastik 和斐济 ImageJ 软件对入侵进行成像、测量和分析。该检测平台采用人喉原代细胞和转移性鳞状细胞癌细胞系进行了验证。然而, 该协议也适用于其他固体癌症细胞系。
传统的二维 (2D) 细胞培养研究为癌症研究做出了巨大贡献。目前, 研究人员正更多地转向三维细胞培养检测, 以更好地模仿体内条件1。三维肿瘤细胞培养在细胞和细胞基质相互作用、基因表达谱、药物敏感性和信号转导活性2、3 等方面更准确地反映了复杂的肿瘤微环境。
在肿瘤研究中使用了多种三维细胞培养模型, 如肿瘤组织外植体、芯片上的肿瘤和3、4的多细胞肿瘤球体。多细胞肿瘤球体现在被广泛使用, 因为它们模仿了人类肿瘤 1,5的体内条件的几个特征。当球体直径大于500μm 时, 它甚至有缺氧区域和坏死中心, 因而代表体内肿瘤情况2。
许多合成 (例如, 聚二甲基硅氧烷) 和动物衍生 (例如, 老鼠尾巴类型 i 型胶原蛋白和小鼠肉瘤衍生基质, 基质, 称为 msdm) 矩阵已开发用于三维细胞培养检测3,6, 7,8。到目前为止, 没有一个市售的基质来源于人类肿瘤组织。因此, 它们缺乏人类肿瘤微环境的特征, 对癌细胞的侵袭过程有显著影响8。
肌胶蛋白 (人肌瘤衍生基质, 简称 HMDM) 是从人子宫平滑肌瘤肿瘤组织9中提取的。结果表明, HMDM 的蛋白质含量与 MSDM 有显著差异。事实上, 66% 的 HMDM 蛋白与 MDM 蛋白不同。另一方面, 一些蛋白质, 如层压蛋白, IV 型胶原蛋白, 肝素硫酸盐蛋白多糖, 尼多原和表皮生长因子, 存在于这两个基质 10.此外, 小鼠在酶含量上与人类不同, 人类的蛋白酶比小鼠少78种, 比小鼠少11。
纤维蛋白作为脚手架材料已被单独或与其他材料结合广泛使用.在三维细胞培养检测中, 市售的人纤维蛋白原和凝血酶结合形成纤维蛋白水凝胶12。
该方案描述了以前介绍的3D 肿瘤球体入侵检测7的改进。这一新的方案应用于人类肿瘤衍生基质, 而不是鼠源性肿瘤基质。它还涉及使用 ilastik 和斐济 ImageJ 软件的成像和分析技术。该方案可用于几种不同的固体癌细胞系的球体检测。它为开发新的抗癌疗法和研究特定分子对癌细胞入侵的影响提供了一个与生物学相关的工具。
该方法提供了一种基于三维人体肿瘤的检测方法, 用于评估肿瘤微环境中癌细胞在模拟基质中的侵入性。通过使用标准显微镜的日常成像和图像分析软件, 可以很容易地测量癌细胞的入侵。该方法显示细胞入侵, 而不仅仅是增殖。
与 MDM 不同, Hmdm/纤维蛋白基质不需要任何温度控制。这种方法很容易执行, 特别是不需要将球体从一个盘子转移到另一个板块。它只有一个技术上敏感的步骤, 在基质中添加纤维蛋白原。由于纤维蛋白原在几分钟后开始凝胶, 添加纤维蛋白原需要强大的移液和治疗只有几口井一次。如果移液是以高压方式进行的, 也有干扰球体并将其从 u 形井中心位置移动的风险。球体的错位会使成像和最终的分析复杂化。
该检测方法可通过改变 HMDM 或纤维蛋白原的浓度进行改性。这些细胞也可以被固定和染色, 以便随后进行分子研究。尽管这种方法可以修改为完全自动化的形式, 但也可以用普通显微镜和两个开源软件进行, 不需要昂贵的设备。
与传统的基于 msdm 的三维检测方法相比, 该检测方法能更好地显示细胞入侵特性。生长在含有富含层压蛋白的基底基质中的球虫, 如 MDM, 可能比实际入侵更大的癌细胞增殖, 因此由于其入侵能力较低, 不适合在几个癌细胞系进行入侵检测。另一个常用的基质, I 型胶原蛋白, 往往收缩从边缘在3D 培养过程中, 这影响了球体定位和成像的井。此外, 利用人类肿瘤微环境模拟模型 (myoma 圆盘及其可溶性形态), 证明了多 (HSC-3) 和少 (SCC-25) 侵犯性舌癌细胞系的内在侵入性之间的差异矩阵)10,13。
该检测方法也比使用 MSDM 更符合伦理性, 因为 HMDM 是从人平滑肌瘤肿瘤的剩余物质中提取出来的。目前, hmdm 是唯一可用的人类肿瘤衍生 ecm 产品, 似乎适用于许多癌症相关的体外检测 8,10。今后, 动物组织衍生基质可以被人类肿瘤基基质所取代, 以减少牺牲动物进行基质生产的需要。
用三维方法取代2D 细胞培养检测, 可提供更准确的癌症细胞行为信息。目前, 有几个三维模型和商业矩阵, 但不幸的是, 没有一个适合所有的癌症细胞系。研究人员应选择最适合其特定检测的基质。检测和矩阵的最佳匹配具有挑战性, 但可以显著提高结果的可靠性。
The authors have nothing to disclose.
作者感谢这项研究的资助者: Sizrid Jusélius 基金会、芬兰癌症协会和赫尔辛基大学中心医院研究基金。作者感谢赫尔辛基大学的生物成像部门寻求技术帮助。
Amphotericin B solution | Merck | A2942 | |
Aprotinin from bovine lung | Merck | A6279 | Measure the protein concentration before use. |
Ascorbic acid | Applichem | A1052 | |
BioLite Cell Culture Treated Flasks | Thermo Scientific | 130190 | |
DMEM/F-12 | Gibco by Life Technologies | 31330-038 | |
DS-Fi2 Digital Camera | Nikon Instruments | ||
DS-U3 Digital Camera Controller | Nikon Instruments | ||
Eclipse TS100 Inverted Microscope | Nikon Instruments | ||
Fetal bovine serum (FBS) | Gibco by Life Technologies | 10270106 | Heat inactivate for 30 min at 56°C in waterbath before use. |
Fibrinogen, Plasminogen-Depleted, Human Plasma | Merck | 341578 | Solubility: 25 mg/ml in H₂O. Warm the H₂O and the fibrinogen to 37°C prior to dissolution. Do not disturb until the fibrinogen is completely solubilized. Stock solutions stored at -70°C should be thawed in a water bath maintained at 37°C. |
Fiji ImageJ 1.51 image processing program | Freeware, NIH | ||
Hydrocortisone | Merck | H0888 | |
Ilastik software for image classification and segmentation | Freeware | ||
IncuCyte Zoom Live-Cell Analysis System | Essen BioScience | ||
Myogel | Lab made | ||
Penicillin-Streptomycin | Gibco by Life Technologies | 15140-122 | |
Phosphate buffered saline (PBS) | Lab made | ||
Scepter 2.0 Cell Counter | Merck | PHCC20040 | |
Scepter Cell Counter Sensors, 60 µm | Merck | PHCC60050 | |
Thrombin from human plasma | Merck | T6884-100UN | |
Trypsin-EDTA (0.5%) 10X, no phenol red | Gibco by Life Technologies | 15400054 | |
Ultra-Low Attachment 96-Well Plate | Corning | 7007 | |
UT-SCC-42A and UT-SCC-42-B cell lines | The cell lines were established at the Department of Otorhinolaryngology-Head and Neck Surgery, Turku University Hospital (Turku, Finland). |