Tümör mikroçevre kanser büyüme ve işgali önemli bir parçasıdır. Karsinom ilerlemesini taklit etmek için biyolojik olarak alakalı bir insan matrisine ihtiyaç vardır. Bu protokol, insan leiomyoma tabanlı matris uygulayarak in vitro üç boyutlu küroid invazyonu tahlil için bir gelişme tanıtır. Protokol aynı zamanda bilgisayar tabanlı bir hücre istilası analizi sunar.
İki boyutlu hücre kültürü tabanlı asder yaygın olarak in vitro kanser araştırma kullanılır. Ancak, tümör mikroortamını oluşturacak birkaç temel unsur eksiktir. Daha güvenilir in vitro sonuçlar elde etmek için, birkaç üç boyutlu (3D) hücre kültürü tanıtılmıştır. Bu, kanser hücrelerinin hücre dışı matriks ile etkileşime girmesine izin verir. Bu etkileşim, proliferasyon ve istilanın yanı sıra hücre morfolojisi gibi hücre davranışlarını etkiler. Buna ek olarak, bu etkileşim birkaç yanlısı ve anti-tümörorjenik moleküllerin ifadesine neden olabilir veya bastırabilir. Küroid invazyon tahlil kanser hücresi istilası çalışmak için uygun bir 3D in vitro yöntemi sağlamak için geliştirilmiştir. Şu anda, fare sarkomu-türetilen matris (MSDM) ve sıçan kuyruk tipi ı kollajen gibi hayvansal türevi matrisler, esas olarak küroid istilası alanında kullanılır. İnsan tümörü mikroçevre ve hayvansal türevi matrisler arasındaki farklılıkları dikkate alarak, benign uterus Leyomiyom dokusundan insan Miyoma türevi bir matris (hmdm) geliştirilmiştir. HMDM ‘nin, karsinom hücrelerinden daha iyi bir şekilde göç ve istilası olduğunu göstermiştir. Bu protokol, HMDM/fibrin matrisini kullanarak basit, reproducible ve güvenilir 3D insan tümörü bazlı küroid invazyonu tahlil sağladı. Ayrıca görüntüleme ve analiz hakkında ayrıntılı talimatlar içerir. Kürler, HMDM/fibrin matrisinde U şeklinde Ultra düşük bir ataşman plakası içinde büyür ve onu istila ederler. İstilası günlük, ölçülen ve ılastik ve Fiji ımagej yazılımı kullanılarak analiz edilmiştir. Tahlil platformu insan laringeal primer ve metastatik skuayöz Hücre Karsinomu hücre hatları kullanılarak gösterilmiştir. Ancak, protokol diğer katı kanser hücre hatları için de uygundur.
Geleneksel iki boyutlu (2D) hücre kültürü çalışmaları kanser araştırmalarına önemli ölçüde katkı sağladı. Şu anda, araştırmacılar üç boyutlu (3D) hücre kültürü daha iyi in vivo koşullar1taklit etmek için daha doğru değişen vardır. 3D kanser hücresi kültürü, hücre hücresi ve hücre matris etkileşimleri, gen ifade profilleri, ilaç hassasiyeti ve sinyal yolu aktivitesi2,3açısından karmaşık tümör mikroortamını daha doğru bir şekilde yansıtır.
Çeşitli 3D hücre kültürü modelleri tümör dokusu explant gibi kanser araştırmalarında kullanılır, bir çip üzerinde tümör, ve çok hücreli tümör kürleri3,4. Çok hücreli tümör kürleri artık yaygın olarak kullanılmaktadır, çünkü insan tümörlerinde in vivo koşulların çeşitli özelliklerini taklit eder1,5. Küroid çapı 500 μm ‘ den büyükse, hipoktik bölgelere ve nekrotik bir merkeze sahiptir, böylece in vivo tümör durumu2‘ ye temsil edilir.
Birçok sentetik (örneğin, polydimetilsiloxane) ve hayvan türevi (örn., Rat kuyruk tipi ı kollajen ve fare sarkomu türevi matris, matrigel, MSDM olarak adlandırılır) matrisler 3D hücre kültürü için geliştirilmiştir3,6, 7,8. Şimdiye kadar, piyasada bulunan Matrislerin hiçbiri insan tümörü dokusundan kaynaklanmıştır. Bu nedenle, kanser hücresi invazyonu süreçleri üzerinde önemli etkileri olan insan tümörü mikroortamının özellikleri eksikliği8.
Myogel (insan Miyoma türevi matris, hmdm olarak adlandırılır) insan uterusu Leyomiyom tümör dokusundan ayıklanır9. HMDM ‘nin protein içeriğinin MSDM ‘den önemli ölçüde farklı olduğu gösterilmiştir. Aslında, HMDM proteinlerinin% 66 ‘ i MSDM proteinlerden farklıdır. Öte yandan, laminin, tip IV kollajen, heparan sülfat proteoglycans, Nidogen ve Epidermal büyüme faktörü gibi bazı proteinlerin her iki matrisinde de mevcut olması10. Ayrıca, fare11‘ den daha az protein 78 sahip insanlarla, enzim içeriğinde insan farklı.
Fibrin yaygın olarak tek başına veya diğer malzemeler ile birlikte bir iskele malzemesi olarak kullanılan12. 3D hücre kültüründe, piyasada bulunan insan fibrinojen ve Trombin bir fibrin hidrojel12oluşturmak için birleştirilir.
Bu protokol daha önce tanıtıldı 3D tümör küroid invazyonu tahlil bir iyileştirme açıklar7. Bu yeni protokol, fare türetildiği tümör matrisinin yerine insan tümörü türeyen matris uygular. Ayrıca ılastik ve Fiji ımagej yazılımı kullanarak görüntüleme ve analiz teknikleri içerir. Bu protokol birkaç farklı katı kanser hücresi hatları küroid tahlil için kullanılabilir. Bu yeni anti-kanser tedavileri geliştirmek ve kanser hücresi istilası belirli moleküllerin etkilerini incelemek için biyolojik olarak ilgili bir araç sunuyor.
Sunulan yöntem, matris taklit insan tümörü mikroçevre içinde kanser hücrelerinin invaziv değerlendirmek için bir 3D insan tümörü tabanlı tahlil sağlar. Kanser hücresi istilası, standart mikroskop ile günlük görüntüleme ve görüntü analiz yazılımını kullanarak kolayca ölçülebilir. Yöntem sadece proliferasyon yerine hücre istilası gösterir.
MSDM aksine, HMDM/fibrin matris herhangi bir sıcaklık kontrolü gerektirmez. Bu yöntem, özellikle bir plakadan diğerine kürleri aktarmak için gerek kalmadan, gerçekleştirmek kolaydır. Sadece bir teknik duyarlı adım, matris fibrinojen eklenmesi vardır. Fibrinojen birkaç dakika sonra jel başlar beri, fibrinojen ekleyerek bir defada sadece birkaç kuyuların sağlam pipetleme ve tedavisi gerektirir. Ayrıca, pipetleme yüksek basınçlı bir şekilde yapılırsa, küreyi rahatsız etme ve U şeklindeki iyi merkezi pozisyonuna taşıma riski de vardır. Kürenin dislocation görüntüleme ve sonunda analiz zorlaştırabilir.
Tahlil HMDM veya fibrinojen konsantrasyonu değiştirerek değiştirilebilir. Hücreler de sabit ve sonraki Moleküler çalışmalar için lekeli olabilir. Bu yöntem tam otomatik bir forma değiştirilebilir olsa da, normal bir mikroskop ve iki açık kaynaklı yazılım ile, pahalı donanıma gerek olmadan da gerçekleştirilebilir.
Geleneksel MSDM tabanlı 3D assays ile karşılaştırıldığında, bu tahlil daha iyi hücre istilası özellikleri görüntüleyebilir. , MSDM gibi bir Bodrum membranı içeren laminin zengin matrisinde yetiştirilen küreler, gerçek istiladan daha fazla kanser hücrelerinin proliferasyonu olabilir, bu da düşük istila kapasitesine bağlı olarak çeşitli kanser hücresi hatlarında invazyon için uygun değildir. Başka bir sık kullanılan matris, tip ı kollajen, 3D ekimi sırasında kenarlardan küçültmek eğilimindedir, hangi küre lokalizasyonu ve kuyuların görüntülenmesi etkiler. Ayrıca, daha fazla içsel invaziv özellikleri arasındaki farklar (HSC-3) ve daha az (SCC-25) agresif Dil Karsinomu hücre hatları insan tümörü mikroçevre modelleri taklit kullanılarak gösterilmiştir (myoma diskler ve çözünür formu Matrix)10,13.
Tahlil, hmdm ‘nin insan Leyomiyom tümörünün kalan malzemesinin çıkartıldığı bu yana MSDM kullanmaktan daha etik. Şu anda, hmdm tek mevcut insan tümörü-türev ECM ürün birçok kanserle ilgili olarak uygun görünüyor-vitro asder8,10. Gelecekte, hayvan dokusu-türetilen matrisler, matris üretimi için hayvanları feda etme ihtiyacını azaltmak için insan tümörü bazlı matrisler tarafından değiştirilebilir.
2D hücre kültürü 3D yöntemleri ile değiştirme kanser hücresi davranışı hakkında daha doğru bilgi sağlar. Şu anda, birkaç 3D modelleri ve ticari matrisler vardır, ama, maalesef, hiçbiri tüm kanser hücresi hatları için uygundur. Araştırmacılar kendi özel tahlil için en uygun matris seçmelisiniz. Tahlil ve matris optimum eşleştirme zorlu olabilir, ama önemli ölçüde sonuçların güvenilirliğini artırabilir.
The authors have nothing to disclose.
Yazarlar bu çalışmanın fon teşekkür: Sigrid Jusélius Vakfı, Kanser Derneği Finlandiya ve Helsinki Üniversitesi Merkez Hastanesi araştırma fonları. Yazarlar, teknik yardım için Helsinki Üniversitesi ‘nde Biomedicum görüntüleme birimini kabul eder.
Amphotericin B solution | Merck | A2942 | |
Aprotinin from bovine lung | Merck | A6279 | Measure the protein concentration before use. |
Ascorbic acid | Applichem | A1052 | |
BioLite Cell Culture Treated Flasks | Thermo Scientific | 130190 | |
DMEM/F-12 | Gibco by Life Technologies | 31330-038 | |
DS-Fi2 Digital Camera | Nikon Instruments | ||
DS-U3 Digital Camera Controller | Nikon Instruments | ||
Eclipse TS100 Inverted Microscope | Nikon Instruments | ||
Fetal bovine serum (FBS) | Gibco by Life Technologies | 10270106 | Heat inactivate for 30 min at 56°C in waterbath before use. |
Fibrinogen, Plasminogen-Depleted, Human Plasma | Merck | 341578 | Solubility: 25 mg/ml in H₂O. Warm the H₂O and the fibrinogen to 37°C prior to dissolution. Do not disturb until the fibrinogen is completely solubilized. Stock solutions stored at -70°C should be thawed in a water bath maintained at 37°C. |
Fiji ImageJ 1.51 image processing program | Freeware, NIH | ||
Hydrocortisone | Merck | H0888 | |
Ilastik software for image classification and segmentation | Freeware | ||
IncuCyte Zoom Live-Cell Analysis System | Essen BioScience | ||
Myogel | Lab made | ||
Penicillin-Streptomycin | Gibco by Life Technologies | 15140-122 | |
Phosphate buffered saline (PBS) | Lab made | ||
Scepter 2.0 Cell Counter | Merck | PHCC20040 | |
Scepter Cell Counter Sensors, 60 µm | Merck | PHCC60050 | |
Thrombin from human plasma | Merck | T6884-100UN | |
Trypsin-EDTA (0.5%) 10X, no phenol red | Gibco by Life Technologies | 15400054 | |
Ultra-Low Attachment 96-Well Plate | Corning | 7007 | |
UT-SCC-42A and UT-SCC-42-B cell lines | The cell lines were established at the Department of Otorhinolaryngology-Head and Neck Surgery, Turku University Hospital (Turku, Finland). |