マウスの骨格筋を用いて小角X線回折実験を行うための詳細なプロトコルを提示する。ヒト疾患のトランスジェニックマウスモデルの広い可用性により、この実験プラットフォームは、遺伝的筋肉疾患の構造的基盤を解明するための有用な試験ベッドを形成することができます
トランスジェニックマウスモデルは、骨格筋を含むヒト疾患の表現型との関係を研究するための重要なツールとなっている。マウス骨格筋は、第3世代シンクロトロンビームライン上で高品質のX線回折パターンを生成することが示されており、遺伝子型のレベルでの変化を健康と疾患の機能性表現型にリンクする機会を提供する。遺伝的変化の構造的な結果。 我々は、試料の調製、X線パターンの収集、およびX線パターンから関連する構造パラメータを抽出するための詳細なプロトコルを提示し、そのような実験を自分で行いたいと考える実験者を導くのに役立つ可能性がある。
シンクロトロン小角X線回折は、生理的条件下で積極的に筋調を収縮させるnmスケール構造を研究するための選択の方法である。重要なことは、生きているか、または皮を剥がされた筋肉の調製物からの構造情報は、筋肉の力および長さの変化のような生理学的データと同期して得ることができる。肉質タンパク質の点変異の基礎を持つ遺伝性筋肉疾患の構造的基礎を研究するために、この技術を適用することに関心が高まっています。筋肉生物物理学コミュニティは、構造研究のための理想的なテストベッドを提供することができ、これらのヒト疾患条件のためのトランスジェニックマウスモデルの生成に非常に積極的にされています。私たちのグループ1、2、3および他の4、5からの最近の出版物は、マウス伸張デジトドーロン(EDL)およびソ底筋からのX線パターンがすべてのカエルやウサギのプソアス骨格筋などのより伝統的なモデル生物から入手可能な回折情報。マウス骨格筋調製の利点は、解剖の容易さと基本的な膜無傷、全筋肉生理学的実験を行うことである。解剖された筋肉の寸法は、第3世代X線ビームライン上の非常に短いX線暴露時間(フレーム当たり〜ミリ秒)で非常に詳細な筋肉パターンを得るのに十分な質量を有する。
筋肉X線回折パターンは、赤道反射、経線反射、および層線反射で構成されています。赤道強度比(1,1および1,0赤道反射の強度の比、I11/I10)は、マウス骨格筋で発生する力に比例する接続された架橋の数と密接に相関している。2.厚く薄いフィラメント内の周期性を報告する経年反射は、フィラメントの拡張性1、3、6、7を推定するために使用することができる。子午線と赤道にない回折特徴は、厚いフィラメントの背骨の表面にほぼ順次ミオシンヘッドと、ほぼ階層的に順序付された薄いフィラメントから生じる層線と呼ばれています。ミオシン層線の強度は、様々な条件2、8の下でミオシンヘッドの順序の程度に密接に関連しています。この情報のすべては、健康および疾患におけるその中の肉皮タンパク質の挙動を研究するために使用することができる。
筋肉のシンクロトロンX線回折は、歴史的に高度に専門の専門家のチームによって行われてきましたが、技術の進歩と新しいデータ削減ツールの可用性は、これが常にそうである必要は限らないことを示しています。高度なフォトンソースのBioCATビームライン18IDは、アルゴンヌ国立研究所は、これらの技術を使用して、フィールドへの新規参入者が始めるのを助けることができる筋肉X線回折実験を行うための専用のスタッフとサポート施設を持っています。多くのユーザーが BioCAT スタッフと正式に共同作業を行うことを選択しますが、ビームラインスタッフの負担を軽減するために、実験や分析自体を行うことができるユーザーが増えています。本論文の主な目的は、BioCATビームラインまたは周囲の他の高流束ビームラインでマウス骨格筋系の実験を計画し、実行するために必要な情報を潜在的な実験者に提供するトレーニングを提供することです。これらの実験が可能になる世界。
我々のグループからの最近の出版物は、マウスの骨格筋からのX線パターンが健康および疾患の筋肉からの肉体構造情報に光を当てるのに特に使用できることを示した1、2、3様々なミオパシーに対する遺伝的修飾マウスモデルの利用可能性の増加。X線回折と組み合わせた単一繊維または小さな束に関する高解像度の機械的研究は、専門家によって行われるのが最善です。しかし、より控えめな機械的情報があなたの目的のために十分である場合は、筋肉全体の準備は、簡単な準備から詳細なX線パターンの収集を可能にします。
クリーンな解剖は、機械とX線の組み合わせ実験を成功させる鍵です。これは筋肉の一部を引き裂き、力の低下につながる可能性があるため、解剖中に底手またはEDL筋肉に関連する他の筋肉だけでなく、ターゲットの筋肉を引っ張らないことは非常に重要です。また、X線パターンを劣化させる損傷した内部構造につながる可能性があります。すべてがX線ビームに散乱するので、次のプロトコルを行っている間、余分な脂肪、筋膜のコラーゲンだけでなく、任意の毛や組織の緩いビットを掃除することが重要です。筋肉の準備における追加のコンプライアンスを減らすためには、腱をフックにしっかりと結び付け、可能な限り筋肉体に損傷を与えずに結びつけることも重要です。
異なるX線暴露時間は、同じ筋肉から異なる種類の情報を提供することができます。18IDのフルビームを使用して、1ミリ秒の露出で分析可能な赤道パターンを得ることができます(図2D参照)。分析可能な最初のミオシン層線反射の場合、通常は 10 ミリ秒の総露光時間が必要です。M15(2.8 nmミオシン経膜反射)や2.7nmアクチン経膜反射などの高次子午線反射を収集するには、通常、少なくとも1sの総露出が必要ですが、高精度のために2s以上の総露出が推奨されます。測定。
実験に最適なX線検出器の選択は重要です。最も詳細なX線パターンの場合、BioCATの40 μmピクセルと約65 μmポイントスプレッド関数を備えたカスタマイズされたCCD検出器は、高いダイナミックレンジと良好な空間分解能を持つパターンを提供できますが、一度に1フレームしか取ることができます。 時間分解実験では、BioCATの光子計数ピクセルアレイ検出器は、500 HzでX線パターンを収集できます。しかし、この検出器を使用した172 μmピクセルサイズは、子午線の内側部分の詳細な研究に十分な空間分解能を提供しませんが、他のほとんどの目的には十分です。BioCATは、最大フレームレート9,000 Hzで75μmの実解像度を提供する高解像度光子計数検出器を取得しました。
第3世代のシンクロトロンではX線の流束が非常に高く、放射線障害が深刻な懸念事項となっています。目的の回折フィーチャを観察するために必要以上のビームを提供するために、ビームを減衰させるのは常に良い選択です。減衰ビームからの露光時間を延長することで、同じ総X線露光を達成することができます。フォトンカウントピクセルアレイ検出器の利点は、個々のフレームをノイズペナルティなしで一緒に合計できることです。それでも、放射線によるダメージは可能です。放射線損傷の徴候は収縮の最大力の低下、層線反射の塗りつぶし、さらには筋肉の色の変化を含む。
無傷のマウス骨格筋調製の限界の一つは、実験中に無傷の筋肉からサルコメアの長さを得ることの難しさである。筋肉は、ビデオ顕微鏡とレーザー回折のために厚すぎる。将来の開発では、回折パターン14から直接サルコメア長を推定することが可能であるが、短期的には、ここで説明するように実験後にそれを測定する唯一の選択肢である。
The authors have nothing to disclose.
この研究は、アルゴンヌ国立研究所が運営する米国エネルギー省(DOE)科学ユーザー施設の先端光子源のリソースを使用しました。DE-AC02-06CH11357。このプロジェクトは、国立衛生研究所の国立総合医学研究所からの助成金P41 GM103622によって支援されました。ピラタス3 1M検出器の使用はNIGMSからの認可1S10OD018090-01によって提供された。内容は著者の責任の一部であり、必ずしも国立一般医学研究所または国立衛生研究所の公式見解を反映するものではありません。
#5 forceps | WPI | 500342 | |
4/0 surgical suture | Braintree Sci | SUT-S 108 | |
aquarium air stone | uxcell | a regular air stone from a pet store would be fine | |
CaCl2 | Sigma-Aldrich | C5670 | |
CCD detector | Rayonix Inc | MAR 165 CCD | |
data accquisition system | Aurora Scientific Inc | 610A | |
elastomer compound | Dow Corning | Sylgard 184 | |
Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
High resolution photon counting detector | Dectris Inc | EIGER X 500K | |
high-power bi-phasic current stimulator | Aurora Scientific Inc | 701 | |
Iris Scissors | WPI | 501263-G | |
KCl | Sigma-Aldrich | P9541 | |
MgSO4 | Sigma-Aldrich | M7506 | |
micro scissor | WPI | 503365 | |
motor/force transducer | Aurora Scientific Inc | 300C-LR | |
NaCl | Sigma-Aldrich | S9888 | |
petri-dish | Sigma-Aldrich | CLS430167 | |
photon counting detector | Dectris Inc | Pilatus 3 1M | |
Stainless Steel wire | McMaster-carr | 8908K21 | |
Suture Tying Forceps | WPI | 504498 | |
Video sarcomere length measuring system | Aurora Scientific Inc | 900B |