我们提出了使用完整的小鼠骨骼肌肉进行小角度X射线衍射实验的详细方案。该实验平台具有广泛的人类疾病转基因小鼠模型,可形成一个有用的试验台,用于阐明遗传性肌肉疾病的结构基础。
转基因小鼠模型是研究基因型与表型对人类疾病(包括骨骼肌)的表型关系的重要工具。小鼠骨骼肌已被证明能在第三代同步辐射束线上产生高质量的X射线衍射模式,通过确定基因型水平的变化与健康和疾病的功能表型联系起来提供了机会基因变化的结构后果。 我们提出了制备标本的详细方案,收集了X射线模式,并从X射线模式中提取相关的结构参数,这些可能帮助指导希望自己进行此类实验的实验者。
同步加速器小角度X射线衍射是研究生理条件下主动收缩肌肉制剂的纳米尺度结构的首选方法。重要的是,从活或皮肤肌肉制剂的结构信息可以与生理数据同步获得,如肌肉力和长度变化。人们越来越关注应用这项技术来研究遗传性肌肉疾病的结构基础,这些疾病在肉瘤蛋白的点突变中具有基础。肌肉生物物理学界一直非常积极地为这些人类疾病条件生成转基因小鼠模型,为结构研究提供理想的试验台。我们组1、2、3和其他4、5的近期出版物表明,来自小鼠扩展器(EDL)和底板肌肉的X射线模式可以提供所有衍射信息可从更传统的模型生物,如青蛙和兔子骨骼肌。小鼠骨骼肌制剂的一个优点是易于解剖,并进行基本的膜保存,整个肌肉生理实验。解剖肌肉的尺寸有足够的质量,在第三代X射线光束线上非常短的X射线暴露时间(每帧+毫秒)产生非常详细的肌肉模式。
肌肉X射线衍射模式由赤道反射、经线反射以及图层线反射组成。赤道强度比(1,1 和 1,0 赤道反射的强度比,I11/I10)与附加交叉桥的数量密切相关,这与小鼠骨骼肌产生的力成正比2.在厚细细丝内报告周期性的经络反射可用于估计细丝扩展性 1、3、6、7。不在子午线和赤道上的衍射特征称为层线,其产生于厚细丝骨干表面的近似有序肌苷头以及近似有序的细细细细丝。肌苷层线的强度与肌苷头在各种条件下的排序程度密切相关2、8。所有这些信息都可以用来研究肉瘤蛋白在原位在健康和疾病中的行为。
同步加速器 X 射线肌肉衍射历来由高度专业化的专家团队完成,但技术的进步和新的数据缩减工具的可用性表明,这种情况并不总是如此。在阿贡国家实验室高级光子源的 BioCAT Beamline 18ID 上,有专门的工作人员和支持设施,用于执行肌肉 X 射线衍射实验,帮助新来者开始使用这些技术。许多用户选择与 BioCAT 员工正式协作,但越来越多的用户发现他们可以自行进行实验和分析,以减轻梁线员工的负担。本文的主要目标是提供培训,为潜在的实验者提供所需的信息,以在 BioCAT 光束线或围绕世界,这些实验将是可能的。
我们小组最近的出版物显示,小鼠骨骼肌的X射线模式可以用来揭示肌肉在健康和疾病1,2,3的肉质结构信息,特别是各种月经的转基因小鼠模型的可得性增加。专家最好对单纤维或小束与 X 射线衍射进行高分辨率机械研究。然而,如果更温和的机械信息足以满足您的目的,整个肌肉准备允许从简单的准备收集详细的X射线模式。
清洁解剖是成功进行机械和X射线联合实验的关键。在解剖过程中,不要拉目标肌肉以及与底部或 EDL 肌肉相关的其他肌肉,这是非常重要的,因为这会撕裂部分肌肉并导致力量减少。它还可能导致内部结构损坏,从而降低 X 射线模式。由于一切都会分散在X射线束中,因此在做以下方案时,清除任何多余的脂肪、筋膜中的胶原蛋白以及任何毛发或松散的组织位非常重要。为了减少肌肉准备的额外依从性,还必须将肌腱牢固地绑在钩子上,尽可能靠近肌肉体,而不会损坏肌腱。
不同的X射线暴露时间可以提供不同类型的信息从相同的肌肉。使用18ID上的全光束,可以在1毫秒的曝光中获得可分析的赤道模式(见图2D)。 对于可分析的第一个肌苷层线反射,通常需要 10 毫秒的总曝光时间。要收集更高阶的经线反射,如 M15(2.8 nm 肌苷经反射)和 2.7 nm 行为内经反射,通常需要至少 1 s 的总曝光,但建议超过 2 s 的总曝光,以获得高精度测量。
为实验选择最佳X射线探测器非常重要。对于最详细的 X 射线模式,定制的 CCD 探测器(如 BioCAT 中具有约 40 μm 像素和荧光粉中 ±65 μm 点扩散功能的探测器)可提供具有高动态范围和良好空间分辨率的模式,但一次只能拍摄一帧。 对于时间解析的实验,BioCAT 的光子计数像素阵列探测器可以收集 500 Hz 的 X 射线模式。然而,该探测器的172 μm像素大小不足以为子午线内部部分的详细研究提供足够的空间分辨率,但足以用于大多数其他目的。BioCAT获得了一个高分辨率光子计数探测器,最大帧速率为9,000 Hz,提供75μm的实际分辨率。 类似的此类探测器有望在未来几年内取代目前用于肌肉研究的探测器。
由于第三代同步加速器的X射线通量很高,辐射损伤是一个严重的问题。衰减光束始终是一个不错的选择,以便不提供比观察所需衍射特性所需的光束更多的光束。通过延长衰减光束的曝光时间,可以实现相同的 X 射线总曝光。光子计数像素阵列检测器的一个优点是,单个帧可以一起求和,无需干扰。即便如此,辐射损伤也是可能的。辐射损伤的迹象包括收缩最大力的下降,层线反射的涂抹,甚至肌肉颜色的变化。
完整的小鼠骨骼肌制剂的局限性之一是难以在实验中从完整肌肉获得沙科雷长度。肌肉太厚,无法进行视频显微镜和激光衍射。虽然随着未来的发展,有可能直接从衍射模式14中估计沙科梅长度,但在短期内,唯一的选择就是在实验后测量它,如下所述。
The authors have nothing to disclose.
这项研究利用了美国能源部(DOE)科学用户设施办公室”高级光子源”的资源,该办公室由阿贡国家实验室根据合同号为能源能源科学办公室运营。DE-AC02-06CH11357。该项目得到了国家卫生研究院国家普通医学研究所P41 GM103622的资助。来自NIGMS的授予1S10OD018090-01提供了Pilatus 3 1M探测器的使用。内容完全由作者负责,不一定反映国家普通医学研究所或国家卫生研究院的官方观点。
#5 forceps | WPI | 500342 | |
4/0 surgical suture | Braintree Sci | SUT-S 108 | |
aquarium air stone | uxcell | a regular air stone from a pet store would be fine | |
CaCl2 | Sigma-Aldrich | C5670 | |
CCD detector | Rayonix Inc | MAR 165 CCD | |
data accquisition system | Aurora Scientific Inc | 610A | |
elastomer compound | Dow Corning | Sylgard 184 | |
Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
High resolution photon counting detector | Dectris Inc | EIGER X 500K | |
high-power bi-phasic current stimulator | Aurora Scientific Inc | 701 | |
Iris Scissors | WPI | 501263-G | |
KCl | Sigma-Aldrich | P9541 | |
MgSO4 | Sigma-Aldrich | M7506 | |
micro scissor | WPI | 503365 | |
motor/force transducer | Aurora Scientific Inc | 300C-LR | |
NaCl | Sigma-Aldrich | S9888 | |
petri-dish | Sigma-Aldrich | CLS430167 | |
photon counting detector | Dectris Inc | Pilatus 3 1M | |
Stainless Steel wire | McMaster-carr | 8908K21 | |
Suture Tying Forceps | WPI | 504498 | |
Video sarcomere length measuring system | Aurora Scientific Inc | 900B |