Este protocolo describe los pasos necesarios para generar un modelo de sistema en que se puede regular la transcripción de un gen endógeno de interés condicional en animales vivos o células con mayor lac represor y tet activador de sistemas.
Aquí se describe un protocolo para la implantación del sistema de control remoto (Reversible Manipulation of Transcription en Endogenous loci), que permite para el control de la expresión reversibles y regulables de un gen endógeno de interés en la vida del modelo de sistemas. El sistema de control remoto emplea sistemas de activación de mejorada lac de la represión y tet para lograr abajo – o regulación al alza de un gene de la blanco dentro de un sistema biológico único. Represión apretado puede lograrse de flexible encuentra sitios de unión del represor lejos río abajo de un sitio de inicio de transcripción por inhibición de la elongación de la transcripción. Upregulation robusto puede lograrse incrementando la transcripción de un gen endógeno dirigiéndose a activadores transcripcionales de tet al promotor cognado. Este control reversible y armoniosa expresión pueda ser aplicado y retirado varias veces en los organismos. La potencia y la versatilidad del sistema, según lo demostrado por endógeno Dnmt1 , permitirá más precisos análisis funcionales in vivo permitiendo la investigación de funciones de los genes en los distintos niveles de expresión y por la prueba de la reversibilidad de un fenotipo.
Knockout genético o enfoques transgénicos han sido medios eficaces para estudiar la función génica en modelos animales. Sin embargo, la regulación de la expresión de estos enfoques es dicotómica (encendido/apagado), no temporal y así no es capaz de revelar el espectro funcional completado de un gen. Condicional Cre/LoxP tecnologías han permitido spatio-temporal inactivación o activación de funciones de los genes, pero su naturaleza dicotómica continúa planteando limitaciones, tales como la mortalidad celular irreversible y1,2 , 3. con el fin de llenar este vacío, condicional precipitación se han desarrollado con tet-regulado shRNA o miRNA4. Sin embargo, los efectos off-target siguen siendo una preocupación para RNAi5 y difíciles de controlar en vivo. Más recientemente, CRISPR/Cas-mediada por tecnologías de control transcripcional han introducido un enfoque más versátil para lograr tanto arriba y desregulación de la expresión génica endógena y demostró sus utilidades6,7 . Sin embargo, la efectividad del control transcripcional CRISPR/Cas-mediada aún es confusa en vivo y la reversibilidad de la basado en KRAB represión queda vista, fuerte represión por parte de KRAB y sus proteínas interactuantes KAP1 ha demostrado inducir 8,9el silenciamiento del gen permanente.
Para hacer frente a estas limitaciones, hemos desarrollado un novedoso sistema de regulación transcripcional capaz de controlar condicionalmente la expresión de genes endógenos en un reversible y manera armonioso en ratones mediante ingeniería transcripcional procariota binario sistemas de regulación10. Procariotas sistemas de regulación transcripcionales binario con ligandos reguladoras, como la lac y tet, han permitido tal reversible y armoniosa expresión control11,12,13, 14. sin embargo, la potencia de represión inadecuada de los sistemas binarios actuales ha impedido su adopción amplia para controlar la expresión de genes endógenos en mamíferos. Hemos desarrollado un sistema de represión de lac mejorado suficientemente potente para la represión de genes endógenos y empleó una nueva estrategia de focalización activadores transcripcionales tet directamente al cognado promotor de un gen endógeno para lograr upregulation robusta (figura 1)10. Con esta tecnología, hemos conseguido casi dos órdenes de magnitud control de expresión del gen Dnmt1 endógeno en un armonioso, inducible y reversible de manera10. Aquí proporcionamos instrucciones detalladas para su aplicación en vivo a otros genes y organismos usando ratones como especie modelo.
Figura 1 : Resumen del sistema de control remoto. La transcripción de un gen endógeno objetivo puede regularse utilizando ingeniería lac represor y tet activador sistemas. El promotor del gen blanco o intrón está diseñado para contener operadores para el represor de LacIGY apretado-que atan o rtactivador TA-M2. R indica Repron (Represión intron), que contiene 12 operadores lac simétrico (S) además un intron de beta-globina conejo parcial. T indica el operador de TTE . El represor o activador está/se expresan de un promotor específico de tejido. La expresión del gen objetivo puede entonces reversible ajustarse al nivel deseado de la expresión administración de IPTG (Isopropil β-D-1-tiogalactopiranósido, un antagonista del LacIGY represor) o doxiciclina (Dox). Esta figura ha sido modificada de Lee et al.10haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Antes de iniciar este protocolo, revisar cuadro 1 para identificar las medidas pertinentes para el control deseado de la expresión génica. Por ejemplo, para diseñar un ratón que permite reversible downregulation de “Gen X”, complete las secciones 1, 3 y 4 del siguiente protocolo. También, la tabla 1 resume los componentes necesarios del sistema de control remoto.
Cambio de expresión deseada | Represión sólo | Activación sólo | Activación y represión |
Secciones pertinentes del Protocolo de | 1, 3-4 | 2-4 | 1-4 |
Secuencia de control remoto en Gene de la blanco | Repron (“Intrón de represión”; 12 operadores lac simétrica más un intrón de beta-globina conejo parcial) | Operadores de Tet | Operadores Repron y Tet |
Ubicación de la secuencia de control remoto | Intrón | Promotor | Intrón y promotor |
Activador/represor necesario para el Control deseado | LacIGY represor | Activador de rtTA M2 | LacIGY represor y activador rtTA M2 |
Ligandos reglamentarios | IPTG | Doxiciclina | IPTG o doxiciclina |
Tabla 1: Resumen de componentes de control remoto.
Un paso crítico y una limitación potencial del sistema de control remoto es el reto asociado con la inserción del represor o sitios de unión del activador sin afectar la expresión del gen objetivo. Nuestro enfoque de represión original, tal como se aplica al gen Dnmt1 , implicó la inserción de sitios de unión de represor lac dentro de regiones transcripcionalmente críticas de un promotor. Para reducir el riesgo de afectar la función de promotor y por lo tanto a mejorar la aplicabilidad general del sistema de control remoto, hemos desarrollado un enfoque basado en el intrón de la represión. La potencia de nuestro sistema mejorado lac permitió reprimir firmemente la transcripción de todos los promotores fuertes, probamos a operadores ubicados cientos a varias kilobases abajo de la transcripción Inicio sitios (figura 3A, C) 10. lo importante, los niveles de represión eran independientes de los puntos fuertes transcripcionales de los promotores (figura 3A – C)10. Esto sugiere que la capacidad de represión de nuestro sistema de represión basado en el intrón supera la fuerza transcripcional de los promotores de la prueba. En este enfoque basado en el intrón, es probable que la represión es mediada a través de la interferencia física entre dos componentes, el mecanismo de elongación de la transcripción y los represores lac del57. Este mecanismo de represión simple y la robustez demostrada del método basado en el intrón pueden representar este enfoque general aplicable a los organismos, tejidos y genes diferentes.
La regulación al alza por el sistema de control remoto requiere las secuencias de enlace transactivator en proximidad con el promotor del gene de la blanco, que entraña un riesgo de afectar la función de promotor. Sin embargo, encontramos que la posición de enlace de secuencias puede ser fuera de la región transcripcionalmente crítica. Dnmt1 y EF1α promotores fueron firme alza de operadores tet encuentra un par de cien bases aguas arriba de la transcripción Inicio sitios10. Esta restricción relajada reduce considerablemente la posibilidad de afectar la función de promotor de un gene de la blanco en ausencia del transactivator. Aumentar el número de enlace de secuencias o uso de transactivators más fuerte podría ayudar a reducir el riesgo al permitir upregulation de sitios más lejos de la página de inicio de transcripción.
Nuestro sistema de control remoto proporciona un elegante control del nivel, el momento y el lugar de la expresión de genes endógenos, lo que permite la reversibilidad de un fenotipo y las consecuencias de los niveles de expresión diferente, que no son fácilmente alcanzables por la prueba tecnologías actuales en vivo gene expresión de control. Es importante tener en cuenta que en la mayoría análisis de expresión del gene, incluido el nuestro, expresión valores representan la media de una población de células entre las que se puede encontrar una variación considerable. Esta heterogeneidad puede influir en procesos celulares de la toma de decisiones, como diferenciación o apoptosis58. Aunque es probable que la precisión de control de expresión del gene puede mejorarse aún más por circuito genético adicional ingeniería59, la potencia observada de nuestro actual sistema permitirá investigación útil de funciones de los genes en muchos contextos biológicos. Además, se espera un alto grado de especificidad de la blanco debido a la complejidad de las secuencias del operador, así como la gran distancia evolutiva entre los mamíferos y las especies originarias de los componentes regulatorios60. Además, líneas de ratón transgénico de represores y activadores pueden ser desarrolladas y empleadas para cualquier gen endógeno. Por ejemplo, se pueden adaptar modelos de ratón de transactivator de tet existentes para lograr la regulación al alza de un gene de la blanco en los tejidos de ratón deseado. Recientemente hemos desarrollado una línea transgénica que puede conducir robusta expresión tejido-específico de nuestro represor lac mayor en múltiples tipos de tejidos cuando se combina con líneas existentes de la Cre por introducción del gen lacIGY en el locus Hipp11 48 bajo el control de un elemento de Lox-parada-Lox (inédito). Esta línea facilitaría sustancialmente la aplicación de tejidos específicos del sistema de control remoto.
Upregulation de gene por el sistema de control remoto ofrece varias ventajas en comparación con el actuales enfoques transgénicos inducibles. No requiere generación de varias líneas transgénicas para probar efectos de posición de la inserción, ya que utiliza el locus endógeno. Además, este enfoque es adecuado para upregulation de los genes con expresión de base fuerte debido a aumenta la expresión de un promotor ya sólido, mientras que los modelos transgénicos dependen de promotores virales mínimas. Por último, el tejido especificidad, control del ciclo celular y que empalman la variantes de un gene de la blanco pueden conservarse al upregulation de nuestro enfoque, que conserva elementos de regulación natural como natural cis-elementos reguladores. El advenimiento de la tecnología de gene targeting CRISPR/Cas-mediada facilitan enormemente la aplicación de esta tecnología en sistemas de diversos modelos.
The authors have nothing to disclose.
Agradecemos a la tarde el Dr. Heidi Scrable por su generosa donación de la construcción de gen lacI mamíferos (Mayo Clinic, Rochester, MN), Dr. Daniel Louvard (Instituto Curie, Paris, Francia) para que el promotor de bandido y el Dr. Laurie Jackson-Grusby (Hospital de niños, Boston, MA) por sus contribuciones a las primeras etapas de este desarrollo de la tecnología. Estamos agradecidos por la Dr. Nancy Wu y el Dr. Robert Maxson por su asistencia en la generación de los ratones transgénicos y knockout. Agradecemos a los miembros del laboratorio Laird de discusiones útiles y apoyo. Este trabajo fue financiado por los institutos nacionales de salud [R01 CA75090 DA030325 R01, CA157918 R01 y R01 CA212374 a P.W.L. y 1F31CA213897-01A1 a N.A.V.S].
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