Özet

בידוד והתרבות של תאי גזע עצביים עובריים בעכבר

Published: November 11, 2018
doi:

Özet

כאן, אנחנו מציגים בטכניקה המיקרוכירורגית הרומן על בידודו של תאי גזע עצביים מ E13 העכבר עובר ganglionic קדושתו.

Abstract

תאי גזע עצביים (NSCs) multipotent, יכולים להצמיח שלושת הסוגים התא העיקריים של מערכת העצבים המרכזית (CNS). In vitro לקשרי תרבות והרחבה של NSCs מספקים מקור מתאים של תאים עבור מדעני מוח ללמוד את הפונקציה של נוירונים ותאי גלייה יחד עם האינטראקציות שלהם. ישנן מספר טכניקות שדווחו על בידודו של תאי גזע עצביים של המוח בתרבית של מבוגר או העובר. במהלך פעולת המיקרוכירורגית לבודד NSCs מאזורים שונים של מערכת העצבים עובריים, חשוב מאוד לצמצם את הנזק לתאי המוח כדי לקבל את היחס הגבוה של תאי גזע בשידור חי וניתן להרחבה. טכניקה אפשרית להפחתת מתח במהלך בידוד התאים האלה מהמוח העובר העכבר הוא צמצום זמן כירורגי. . הנה, נדגים טכניקה שפותחה עבור בידוד מהיר של תאים אלה מן E13 העכבר עובר ganglionic קדושתו. ניתוחים כוללות קצירת E13 העכבר העוברים מן הרחם, חותכים את פונטאנלה חזיתית של העובר עם טיפ המחט בנט, חילוץ במוח הגולגולת, microdissection של המוח מבודדים לקצור את קדושתו ganglionic, דיסוציאציה של הרקמה שנקטפו במדיום לבטחון לאומי כדי לקבל השעיה תא בודד, ולבסוף תאי ציפוי בתרבות ההשעיה ליצירת neurospheres.

Introduction

תאי גזע עצביים (NSCs) מתגוררים באזורים שונים של המוח מבוגר ואת העובר, ויש להם נטייה ליצור סוגים שונים של נוירונים, תאי גליה1. האזורים subventricular המוח יונקים בוגרים2 קדושתו ganglionic במוח העובר לבטחון לאומי אזורים עשירים3בקרב אנשי עסקים ותיירים כאחד. במוח המתפתח, מספק קדושתו ganglionic רוב interneurons קורטיקלית במיוחד GABAergic interneurons3. יש גם שיטות פולשניות פחות לייצור תאי גזע עצביים מתאי גזע עובריים (ESCs) או להשתמש בתאי גזע pluripotent מושרה (iPSCs) להפחית את הביקוש חיה. למרות העובדה כי יצירת NSCs ESCs או iPSCs הוא אפשרי4,5, זה יש כמה יתרונות וחסרונות לעומת הבידוד של תאי גזע עצביים מבוגר או העובר המוח6,7, 8. הפרוטוקולים עבור גרימת את הבידול של ESCs ו- iPSCs לכיוון פנוטיפים עצביים הם תמיד זמן ועלות לצרוך, הקצב של הצלחה (70-80% Nestin חיובי תאים)5 מושווה נמוך עם בידוד ישיר של NSCs מ (החייתי במוח יותר מ-99% Nestin חיובי תאים)9. יתר על כן, תאי גזע לאבד את נטייתם הגנטית של יציבות ובידול אחרי קטעים מספר10,11. למרות שישנם דיווחים חדשים אחרים על המרה ישירה של תאים סומטיים לתוך NSCs, תאים אלה הם מהונדסים גנטית והם אינם נגישים בקלות בכל מעבדה12. לכן, עדיין יש ביקוש גדול עבור בידוד של תאי גזע עצביים מהמוח בעלי חיים; זה אפשרי לצמצם את כמות השימוש בבעלי חיים על ידי שיפור טכניקות כירורגיות. על-ידי הפחתת זמן ניתוח ושיפור הטכניקות, זה אפשרי לשמור תאים מן הנזק ולקבל שיעור הגבוה ביותר של NSCs של כל בעל חיים.

כאן, אנחנו מציגים טכניקה פשוטה and לשחזור עבור בידוד של תאי גזע עצביים של מוח העובר13 העכבר E.

Protocol

כל ניתוחים ופרוצדורות על בעלי חיים אושרו על ידי ועדת האתיקה בעלי חיים של מכון Royan, טהראן, איראן. 1. הכנת מכשירי ניתוח שוטף מאגר (HEPES-מ), תא תרבות המדיה וצלחות תרבות תא לחטא כלים כירורגיים (מספריים, סכין להב ידית ומלקחיים) על ידי autoclaving שאותם בהתבסס על הקווים המנחים עיקור שגר?…

Representative Results

ניתוח מיקרו, בידוד תא ותרבות Neurosphere. כאן, אנו הציג שיטה מהירה ויעילה העכבר E13 המוח למיקרו ובידוד של תאי גזע עצביים. מאמר זה מראה שזה אפשרי להסיר את כל המוח גולגולת העובר E העכבר13 דרך קרע בסדר ב פונטאנלה חזיתית. בשיטה זו, המוח מחזיקה מעמד פחות נזק, וזה אפשר…

Discussion

היא מאוד חשוב עבור מדעני מוח בעזרת מקור מתאים של תאי גזע עצביים. תאי גזע עצביים יכול להיות שנקטפו מאזורים שונים במוח העובר, הם יכולים ליצור סוגים ספציפיים של נוירונים ותאי גלייה. ישנן מספר שיטות אינדוקציה של ההתמיינות של תאי גזע עצביים כדי לגרום להם לייצר נוירונים בוגרים ותאי גלייה. ישנם ד?…

Açıklamalar

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

עבודה זו נתמכה על ידי המכון Royan.

Materials

15 mL tubes Falcon 352097
50 mL tubes Falcon 352235
Adson Forceps, 12 cm, Straight WPI 14226
B27 Gibco 17504-44
bFGF Sigma F0291
bovine serum albumin (BSA) Sigma A2153
dish 10cm  Falcon 353003
Dressing Forceps, 12.5 cm, Straight WPI 15908
Dumont Tweezers, 11 cm, Straight WPI 500342
EGF Sigma E9644
Ethanol Merck 100983 
Glutamate Sigma  G3291
Glutamax Gibco 35050061
goat anti rabbit FITC conjugated secondary antibody Sigma AP307F
goat serum Sigma G9023
Heparin   Sigma h3149
HEPES Sigma 83264
HEPES Sigma 90909C
insulinsyringe with 25-27 gauge Needle  SUPA medical A1SNL127
laminin sigma    L2020
MEM Sigma M2279
N2 supplement Gibco 17502048
NB medium Gibco 21103-31
Non-essential amino acid (NEAA) Gibco 11140050
PBS without Ca and Mg Gibco 20012050
Penicilin/ Streptomycin Gibco 5140122
Poly-L-ornithine Sigma  P4957
rabbit anti mouse beta tubulin-III antibody Sigma T2200
rabbit anti mouse GFAP antibody Sigma G4546
rabbit anti mouse Nestin antibody Sigma N5413
Scalpel Handle #3 WPI 500236
Scissors curve WPI 14396
Scissors sharp straight WPI 14192
Soybean trypsin inhibitor Roche 10109886001 
Tissue culture flasks, T25 BD 353014
Tissue culture flasks, T75 BD 353024
Tween 20 Sigma P1379
Vannas Scissors,  8 cm, Straight  WPI 14003
β-mercaptoethanol Sigma M6250

Referanslar

  1. Navarro Quiroz, E., et al. Cell Signaling in Neuronal Stem Cells. Cells. 7 (7), (2018).
  2. Choi, C. I., et al. The Thrombin Receptor Restricts Subventricular Zone Neural Stem Cell Expansion and Differentiation. Scientific Reports. 8 (1), 9360 (2018).
  3. Li, H., et al. Isolation of a novel rat neural progenitor clone that expresses Dlx family transcription factors and gives rise to functional GABAergic neurons in culture. Developmental Neurobiology. 72 (6), 805-820 (2012).
  4. Liu, Y., et al. Derivation of phenotypically diverse neural culture from hESC by combining adherent and dissociation methods. Journal of Neuroscience Methods. , (2018).
  5. Dhara, S. K., et al. Human neural progenitor cells derived from embryonic stem cells in feeder-free cultures. Differentiation. 76 (5), 454-464 (2008).
  6. Aligholi, H., Hassanzadeh, G., Gorji, A., Azari, H. A Novel Biopsy Method for Isolating Neural Stem Cells from the Subventricular Zone of the Adult Rat Brain for Autologous Transplantation in CNS Injuries. Methods in Molecular Biology. 1462, 711-731 (2016).
  7. Azari, H., Sharififar, S., Rahman, M., Ansari, S., Reynolds, B. A. Establishing embryonic mouse neural stem cell culture using the neurosphere assay. Journal of Visualized Experiments. (47), (2011).
  8. Ferrari, D., Binda, E., De Filippis, L., Vescovi, A. L. Isolation of neural stem cells from neural tissues using the neurosphere technique. Current Protocols in Stem Cell Biology. , (2010).
  9. Guo, W., Patzlaff, N. E., Jobe, E. M., Zhao, X. Isolation of multipotent neural stem or progenitor cells from both the dentate gyrus and subventricular zone of a single adult mouse. Nature Protocols. 7 (2012), (2005).
  10. Liu, P., et al. Passage Number is a Major Contributor to Genomic Structural Variations in Mouse iPSCs. Stem Cells and Development. 32 (10), 2657-2667 (2014).
  11. Diaferia, G. R., et al. Systematic Chromosomal Analysis of Cultured Mouse Neural Stem Cell Lines. Stem Cells and Development. 20 (8), 1411-1423 (2011).
  12. Hemmer, K., et al. Induced Neural Stem Cells Achieve Long-Term Survival and Functional Integration in the Adult Mouse Brain. Stem Cell Reports. 3 (3), 423-431 (2014).
  13. Menon, V., Thomas, R., Ghale, A. R., Reinhard, C., Pruszak, J. Flow Cytometry Protocols for Surface and Intracellular Antigen Analyses of Neural Cell Types. Journal of Visualized Experiments. (94), 52241 (2014).
  14. Zhang, Z., Wang, Z., Rui, W., Wu, S. Magnesium lithospermate B promotes proliferation and differentiation of neural stem cells in vitro and enhances neurogenesis in vivo. Tissue and Cell. 53, 8-14 (2018).
  15. Zilkha-Falb, R., Gurevich, M., Hanael, E., Achiron, A. Prickle1 as positive regulator of oligodendrocyte differentiation. Nörobilim. 364, 107-121 (2017).
  16. Wang, L., et al. Oligodendrocyte differentiation from human neural stem cells: A novel role for c-Src. Neurochemistry International. 120, 21-32 (2018).
  17. Palanisamy, A., et al. Oxytocin alters cell fate selection of rat neural progenitor cells in vitro. PLoS ONE. 13 (1), e0191160 (2018).
  18. Llewellyn-Smith, I. J., Basbaum, A. I., Braz, J. M. Long-term, dynamic synaptic reorganization after GABAergic precursor cell transplantation into adult mouse spinal cord. Journal of Comparative Neurology. 526 (3), 480-495 (2018).
  19. Precious, S. V., et al. FoxP1 marks medium spiny neurons from precursors to maturity and is required for their differentiation. Experimental Neurology. 282, 9-18 (2016).

Play Video

Bu Makaleden Alıntı Yapın
Homayouni Moghadam, F., Sadeghi-Zadeh, M., Alizadeh-Shoorjestan, B., Dehghani-Varnamkhasti, R., Narimani, S., Darabi, L., Kiani Esfahani, A., Nasr Esfahani, M. H. Isolation and Culture of Embryonic Mouse Neural Stem Cells. J. Vis. Exp. (141), e58874, doi:10.3791/58874 (2018).

View Video