هذا البروتوكول يصف العمليات العامة ومراقبة الجودة الشيكات اللازمة لإعداد الخلايا المفردة الثدييات الكبار صحية التحضيرات تسلسل الحمض النووي الريبي في خلية مفردة المستندة إلى الحبرية، وارتفاع الإنتاجية. ترتيب المعلمات، محاذاة قراءة وتحليل المصب خلية واحدة bioinformatic تتوفر أيضا.
تحليل التعبير الجيني خلية مفردة عبر آلاف خلايا الفردية داخل الأنسجة أو المكروية أداة قيمة لتحديد تكوين الخلية، والتمييز الدول الوظيفية، والمسارات الجزيئية الكامنة وراء الأنسجة الملاحظة وظائف والسلوك الحيواني. ومع ذلك، يمكن أن يكون تحديا عزل الخلايا المفردة سليمة وصحية من أنسجة الثدييات الكبار للتحليل الجزيئي خلية مفردة المصب اللاحقة. هذا البروتوكول يصف العمليات العامة ومراقبة جودة التدقيق اللازم للحصول على الأعمال التحضيرية خلية مفردة الكبار عالية الجودة من على الجهاز العصبي أو الجلد التي تم تمكين تسلسل خلية مفردة غير متحيزة اللاحقة الجيش الملكي النيبالي والتحليل. كما يتم توفير مبادئ توجيهية لتحليل bioinformatic المتلقين للمعلومات.
مع تطور الإنتاجية العالية التكنولوجيا خلية مفردة1،2 والتقدم في أدوات سهلة الاستعمال المعلوماتية الحيوية على مدى العقد الماضي3، برز حقل جديد لتحليل التعبير الجيني عالية الدقة – خلية واحدة تسلسل الحمض النووي الريبي (سرنا-Seq). ووضعت دراسة التعبير الجيني خلية مفردة أولاً لتحديد عدم التجانس داخل خلية محددة بالسكان، كما هو الحال في الخلايا الجذعية أو الخلايا السرطانية، أو لتحديد السكان نادرة من الخلايا4،5، الذي قد لا يمكن تحقيقه باستخدام تقنيات تسلسل الحمض النووي الريبي السائبة التقليدية. ومكنت الأدوات بيوينفورماتيك تحديد هوية السكان الفرعية رواية (سورا)2، التصور وسام الخلايا على طول بسويدوتيمي الفضاء (مونوكل)6، تعريف الشبكات إشارات نشطة داخل أو بين السكان ( المناظر الطبيعية الخلابة)7، والتنبؤ بجمعية خلايا مفردة في مساحة ثلاثية الأبعاد اصطناعية (سورا، وأكثر)8. مع هذه التحليلات الجديدة والمثيرة المتاحة للمجتمع العلمي، سرنا Seq سريعة-أصبح نهج قياسية جديدة لتحليل التعبير الجيني.
على الرغم من الإمكانات الهائلة ل Seq سرنا، skillsets التقنية المطلوبة لإنتاج مجموعة بيانات نظيفة وتفسير النتائج بدقة يمكن أن يكون تحديا للقادمين الجدد. هنا، بدءاً من عزل الخلايا المفردة من الأنسجة الابتدائية كاملة للتصور وعرض البيانات للنشر يقدم بروتوكول أساسي، ولكنه شامل، (الشكل 1). أولاً، عزل الخلايا المفردة صحية يمكن أن يعتبر تحديا، كما أنسجة مختلفة تتفاوت في درجة حساسية الهضم الأنزيمي والتفكك الميكانيكية اللاحقة. هذا البروتوكول يوفر الإرشاد في هذه الخطوات العزلة، ويحدد نقاط التفتيش مهمة مراقبة الجودة في جميع مراحل العملية. وثانيا، فهم التوافق ومتطلبات بين تكنولوجيا خلية مفردة وتسلسل الجيل القادم يمكن أن يكون مربكاً. هذا البروتوكول يوفر مبادئ توجيهية لتنفيذ منصة المتوازية خلية واحدة سهلة الاستخدام المستندة إلى الحبرية، وإجراء تسلسل. وأخيراً، برمجة الحاسوب شرطا أساسيا هاما لتحليل مجموعات البيانات ترانسكريبتوميك خلية واحدة. هذا البروتوكول يوفر الموارد للشروع في العمل مع لغة البرمجة R، ويقدم توجيهات بشأن تنفيذ مجموعتي R سرنا Seq-الخاصة بشعبية. معا، هذا البروتوكول يمكن توجيه الوافدين الجدد في أداء تحليل Seq سرنا للحصول على نتائج واضحة، والتفسير. هذا البروتوكول يمكن أن يتكيف مع معظم الأنسجة في الماوس، والأهم من ذلك يمكن تعديلها للاستخدام مع الكائنات الأخرى، بما في ذلك الأنسجة البشرية. وسوف يلزم إدخال تعديلات اعتماداً على الأنسجة والمستخدم.
وهناك عدة اعتبارات يجب وضعها في الاعتبار حين عقب هذا البروتوكول؛ 1) بعد جميع المبادئ التوجيهية لمراقبة الجودة في الخطوات 1 و 2 من هذا البروتوكول يوصي بما في ذلك، لضمان تعليق خلية واحدة فقط قابلة للتطبيق لكافة الخلايا داخل عينة مصلحة مع ضمان دقيقة خلية الإجمالي عدد من التهم الموجهة إليه (الملخصة في رقم 2 ). حالما يتحقق ذلك، وإذا ما اتبعت جميع الشروط الأمثل، يمكن أن يكون إسقاط خطوات مراقبة الجودة (لتوفير الوقت–الحفاظ على جودة الجيش الملكي النيبالي، والحد من خلية الخسارة). تؤكد عزلة ناجحة من استمرارية ارتفاع الخلايا المفردة من الأنسجة لمصلحة هو الغاية يوصي قبل أي المصب تجهيز. 2) تقنيات تفارق المفرطة دون قصد نظراً لبعض أنواع الخلايا أكثر حساسية من غيرها التأكيد، يمكن أن التحيز السكان، ولذلك الخلط تحليل المتلقين للمعلومات. الانفصال لطيف دون قص الخلوية لا لزوم لها والهضم أمر بالغ الأهمية لتحقيق ارتفاع غلة الخلوية وتمثيل دقيق لتكوين الأنسجة. قوي القص تحدث خلال الخطوات تريتوريشن، ونظام مراقبة الأصول الميدانية، واستثارة. 3) كما مع أي عمل الجيش الملكي النيبالي، من الأفضل أن إدخال رناسي إضافية صغيرة في العينة قدر الإمكان أثناء الإعداد. وهذا سيساعد في الحفاظ على الحمض النووي الريبي عالية الجودة. استخدام حلول المانع ribonuclease مع الشطف بأدوات نظيفة وأي معدات غير خالية من رناسي ولكن تجنب المنتجات المعالجة ديبك. 4) أداء الأعمال التحضيرية، في أسرع وقت ممكن. وهذا سيساعد على الحفاظ على الحمض النووي الريبي عالية الجودة، والحد من موت الخلايا. اعتماداً على طول تشريح الأنسجة وعدد الحيوانات، النظر في بدء تشريح/استعدادات متعددة في نفس الوقت. 5) إعداد الخلايا على الجليد عند الخلية من الممكن الحفاظ على الحمض النووي الريبي عالية الجودة، والحد من موت الخلايا، وبطء النشاط إرسال الإشارات والنسخي. بعض أنواع الخلايا (مثلاً، العَدلات) أن كان تجهيز المثلج المثل الأعلى لمعظم أنواع الخلايا، أداء أفضل عند معالجة في درجة حرارة الغرفة. 6) تجنب الكالسيوم والمغنيسيوم، يدتا والمنتجات المعالجة ديبك أثناء إعداد الخلية.
هذا البروتوكول يوضح كيف يمكن الكشف عن عدم تجانس النسخي الآلاف من الخلايا المفردة المناسبة إعداد الخلايا المفردة وتميز الدول الوظيفية أو هويات الخلوية فريدة داخل أنسجة. البروتوكول لا يتطلب البروتينات الفلورية مراسل أو الأدوات المعدلة وراثيا ويمكن تطبيقها على عزل الخلايا المفردة من أنسجة مختلفة من الاهتمام بما فيها من البشر؛ مع الأخذ في الاعتبار كل الأنسجة فريدة من نوعها وهذا البروتوكول سوف تتطلب قدرا من التكيف/التعديل.
وأكدت البرامج النسخي متنوعة وديناميكية للغاية داخل الخلايا قيمة الجينوميات خلية واحدة. وبصرف النظر عن عزل الحمض النووي الريبي عالية الجودة، خطوة إعداد عينة حاسمة اللازمة لمجموعات بيانات عالية الجودة هو ضمان أن الخلايا تصدر تماما من الأنسجة وأن خلايا صحية وسليمة. هذا نسبيا على التوالي إلى الأمام لجمع الخلايا بسهولة إصدارها، مثل تعميم خلايا أو أنسجة خلايا فضفاضة استبقي فيها، مثلما حدث في الأنسجة اللمفاوية. ولكن هذا يمكن أن يكون تحديا للأنسجة الأخرى الكبار، بسبب البنية الخلوية متطورة جداً التي تمتد على مسافات كبيرة، المحيطة بالمصفوفة خارج الخلية وبروتينات cytoskeletal جامدة في كثير من الأحيان المشاركة في الحفاظ على هيكل الخلية. حتى مع تقنيات الانفصال المناسبة للإصدار الكامل من الخلايا، هناك إمكانية أن معالجة دقيقة وطويلة وكثيراً ما تتطلب أن يغير سلامة الجودة وخلية مرناً. وبالإضافة إلى ذلك، تؤثر درجات الحرارة العالية المستخدمة للانفصال بمساعدة إنزيم أيضا التوقيعات النسخي29،30. أن قصد البروتوكول تقديم مراقبة الجودة يتحقق، استخدام أنسجة مثل العصب الكبار ميليناتيد والجلد الكبار الغنية بالمصفوفة خارج الخلية، لإظهار كيف يمكن أن تساعد الأمثل للتغلب على هذه العقبات.
أحد الاعتبارات رئيسية عند تصميم أي تجربة Seq سرنا هو اختيار عمق التسلسل. يمكن جداً متعدد التسلسل وقراءة العمق يمكن أن تختلف من كونها منخفضة جداً باستخدام Seq قطره2 ليصل إلى 5 مليون خلية يقرأ/14 استخدام أسلوب تسلسل الحمض النووي الريبي كاملة طول مثل ما يليها الذكية يمكن اكتشاف معظم Seq سكرنا تجارب النصوص التعبير معتدلة إلى عالية مع تسلسل منخفضة قدر ما يلي 10,000/الخلية، وعادة ما تكون كافية للخلية نوع التصنيف41،42. عمق ضحل التسلسل القيمة لإنقاذ على تكاليف التسلسل عند محاولة الكشف عن خلية نادرة السكان عبر الأنسجة المعقدة حيث آلاف خلايا قد تكون مطلوبة لثقة تنسب نادرة السكان. ولكن تسلسل عمق ضحل لا يكفي عند معلومات مفصلة عن التعبير الجيني والعمليات المرتبطة بالتوقيعات النسخي خفية ضروري. ويقدر حاليا، أن يتم الكشف عن الغالبية العظمى من المورثات في خلية ما يلي 500,000/في الخلية، ولكن هذا يمكن أن تختلف تبعاً للبروتوكول والأنسجة اكتب43،44. تكاليف التسلسل بينما تعاقب نسخة كاملة الطول تلتف الحاجة إلى الجمعية، ويمكن، لذلك، الكشف عن رواية أو المتغيرات لصق نادرة، كثيرا ما تحد من توسيع نطاق هذا النهج لدراسة آلاف خلايا التي تتألف من نظام معقد من أنسجة. وفي المقابل، 3 ‘ معلم مكتبات خلية واحدة مثل تلك المبينة في هذا البروتوكول عادة أقل من التعقيد وتتطلب تسلسل ضحالة. من المهم أن نلاحظ أن المكتبات التي تم إنشاؤها باستخدام بروتوكول وصف يمكن أن تكون متسلسلة على واحد من خمسة التعاقب معتمدة: 1) نوفاسيق, 2) هيسيق 3000/4000، 2500 3) هيسيق التشغيل السريع وإخراج عالي، 4) نيكستسيق 500/550 و 5) مسك.
نهج بديل لخلية مفردة الجيش الملكي النيبالي-Seq، أن يقلل من الحاجة إلى الأنسجة الحساسة وخلية معالجة بعد يحافظ على بعض فوائد خلية مفردة تسلسل الحمض النووي الريبي، وإجراء تحليل للحمض النووي الريبي من نواة واحدة45. هذا النهج يسمح أكثر سرعة معالجة الحد من تدهور الجيش الملكي النيبالي، والمزيد من الإجراءات المتطرفة لضمان الإفراج كافية من نوى، والمرجح أن يسمح بالتالي لالتقاط أكثر ثقة من الملامح النسخي يمثلون كافة الخلايا داخل نسيج معين. وبطبيعة الحال، وهذا سيوفر فقط جزء من النشاط الترانسكربتي موجودة داخل خلية معينة، وبالتالي اعتماداً على ما أهداف تجريبية لفائدة هذا النهج قد أو قد لا يكون مناسباً.
بالإضافة إلى توصيف كامل للهويات الخلوية داخل نسيج معين، واحدة من التحليلات الأكثر قيمة لمجموعات البيانات سكرنا Seq هو أنصبة الدول النسخي المتوسطة عبر السكان خلية ‘المعرفة’. يمكن نقل هذه الدول الوسيطة ثاقبة علاقات النسب بين الخلايا داخل السكان التي تم تحديدها، والتي لم يكن من الممكن مع الجملة التقليدية نهج تسلسل الحمض النووي الريبي. الآن وضعت عدة أدوات bioinformatic Seq سرنا لتوضيح هذا. يمكن تقييم هذه الأدوات في عمليات المشاركة في، على سبيل المثال، الخلايا السرطانية الانتقال إلى حالة النمطان/المنتشر، الخلايا الجذعية الناضجة في مصائر المحطة الطرفية المتنوعة أو الخلايا المناعية يتنقلون بين الدول النشطة وهادئة. قد تكون الخلافات الترنسكربيتوم خفية في الخلايا أيضا يدل على التحيزات القائمة على النسب، أدوات bioinformatic وضعت مؤخرا مثل فاتيد، يمكن الاستدلال47. نظراً للفروق بين الانتقال من الخلايا يمكن أن يكون صعباً للتأكد من نظراً للاختلافات النسخي قد تكون خفية، تسلسل أعمق قد يكون ضروريا46. لحسن الحظ، يمكن زيادة التغطية لمكتبة شالوولي التسلسل إذا كان مهتما بسبر dataset المزيد عن طريق إعادة تشغيل المكتبة في آخر تدفق الخلية.
أخذت معا، يوفر هذا البروتوكول سهلة للتكيف مع سير عمل التي تمكن المستخدمين من ترانسكريبتيونالي الشخصية مئات آلاف خلايا مفردة ضمن تجربة واحدة. الجودة النهائية من dataset Seq سرنا يعتمد على التدفق الخلوي وكدنا مكتبة الجيل، عزل الخلية الأمثل وتفسير لمصفوفات الباركود الجين الخام. وتحقيقا لهذه الغاية، يوفر هذا البروتوكول استعراضاً شاملا لجميع الخطوات الرئيسية التي يمكن تعديلها بسهولة لتمكين الدراسات أنواع الأنسجة المتنوعة.
The authors have nothing to disclose.
نعترف بموظفي الدعم في “مرفق خدمات أوكدنا”، وكذلك موظفي مرفق “رعاية الحيوان” في جامعة كالغاري. ونشكر ووركينتيني مات لدعمه المعلوماتية الحيوية وينس دوروثي لدعمه التقني. وكان هذا العمل ممول بمنحه استوفوا (جمهورية مقدونيا وج. ب.)، “جائزة المحقق استوفوا جديدة” إلى ج. ب.، والصحة بحوث المعهد زمالة (ج. س. الطفولة ألبرتا).
Products | |||
RNAse out | Biosciences | 786-70 | |
Pentobarbital sodium | Euthanyl | 50mg/kg | |
HBSS | Gibco | 14175-095 | |
Dispase 5U/ml | StemCell Technologies | 7913 | 5 mg/ml |
Collagenase-4 125 CDU/mg | Sigma-Aldrich | C5138 | 2 mg/ml |
DNAse | Sigma-Aldrich | DN25 | 10mg/ml |
BSA | Sigma-Aldrich | A7906 | |
15 ml Narrow bottom tube VWR® High-Performance Centrifuge Tubes | VWR | 89039-666 | |
Sytox Orange Viability Dye | Molecular Probes | 11320972 | 1.3 nM/µl |
Nuc Blue Live ReadyProbes | Invitrogen | R37605 | |
Agilent Bioanalyzer High senitivity DNA Reagents | Agilent | 5067-4626 | |
Kapa DNA Quantification Kit | Kapa Biosystems | KK4844 | |
Equipment | |||
BD FACSAria III | BD Biosciences | ||
Agilent Bioanalyzer Platform | Agilent | ||
Illumina® HiSeq 4000 | Illumina | ||
Illumina® MiSeq SR50 | Illumina | ||
Software | |||
The Cell Ranger | 10x GENOMICS | support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression | |
/software/overview/welcome | |||
Loupe Cell Browser | 10x GENOMICS | support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression | |
/software/downloads/latest | |||
R | https://anaconda.org/r/r |