Этот протокол описывает общие процессы и контроль качества проверяет необходимые для подготовки здоровых взрослых клеток млекопитающих одной капли основе, высокая пропускная способность одной ячейки РНК-Seq препаратов. Также предоставляются последовательности параметров, чтения выравнивание и вниз по течению одноклеточных bioinformatic анализа.
Анализ экспрессии генов одну ячейку на тысячи отдельных ячеек в ткани или микроокружения является ценным инструментом для выявления клеточный состав, дискриминации функциональных состояний и молекулярные пути, лежащие в основе наблюдаемых ткани функции и поведения животных. Однако изоляции нетронутыми, здоровые клетки одного из взрослых тканей млекопитающих для последующего течению одноклеточного молекулярного анализа может быть сложным. Этот протокол описывает общие процессы и контроль качества проверяет, что необходимо для получения высокого качества взрослые одноклеточного препараты от нервной системы или кожи, включен последующих беспристрастной одноклеточного РНК последовательности и анализа. Также предоставляются рекомендации по течению bioinformatic анализа.
С развитием выдвижений в удобной Биоинформатика инструменты в течение последнего десятилетия3и высокую пропускную способность одной ячейки технологии1,2 возникло новое поле с высоким разрешением ген выражение анализа – Одноместный клеточной РНК последовательности (scRNA-Seq). Изучение экспрессии генов в одной ячейке впервые была разработана для выявления неоднородности в пределах определенных клеточных популяций, такие как в стволовых клеток или раковые клетки, или для выявления редких популяции клеток4,5, которые были недостижимой с помощью традиционных массовых РНК последовательности методов. Инструменты bioinformatic позволили идентификации новых подгрупп населения (сера)2, Визуализация ордена клетки вдоль psuedotime пространства (монокль)6, определение активных сигналов сетей внутри или между населением ( ЖИВОПИСНЫЕ)7, предсказание Ассамблеи сингл-клеток в искусственной 3D пространстве (сера и более)8. Эти новые и захватывающие анализы доступны для научного сообщества scRNA-Seq быстро становится новый стандартный подход для анализа выражения гена.
Несмотря на огромный потенциал scRNA-Seq технические skillsets, требуется производить чистую набора данных и точно интерпретировать результаты может быть сложным для новичков. Здесь основные, но всеобъемлющего протокола, начиная от изоляции единичных клеток от всей первичной тканей для визуализации и представления данных для публикации представлен (рис. 1). Во-первых изоляции здоровых единичных клеток может считаться сложным, как различные ткани различаются по степени их чувствительности к ферментативного пищеварения и последующие механические диссоциации. Этот протокол обеспечивает руководство в эти меры изоляции и идентифицирует важные качества контрольно-пропускных пунктах на протяжении всего процесса. Во-вторых понимание совместимость и требования между технологией одну ячейку и секвенирование нового поколения может быть запутанным. Этот протокол обеспечивает руководящие принципы для реализации платформы удобной, на основе капелька штриховое кодирование одноклеточных и выполнения последовательности. Наконец компьютерное программирование является важной предпосылкой для анализа транскриптомики Одноячеистые наборы данных. Этот протокол предоставляет ресурсы для начала работы с языком программирования R и предоставляет руководство по реализации двух популярных scRNA-Seq-R пакетов. Вместе этот протокол может направлять новичков в анализ scRNA-Seq для получения четких, интерпретируемых результатов. Этот протокол может корректироваться в большинстве тканей в мыши и главное, может быть изменен для использования с другими организмами, включая человеческие ткани. Коррективы в зависимости от ткани и пользователю будет необходимо.
Есть несколько соображений, чтобы иметь в виду, в то время как после этого протокола; включая, 1) после всех руководящих принципов контроля качества в шаги 1 и 2 настоящего Протокола рекомендуется обеспечить жизнеспособные одноклеточного подвеска всех клеток в образце интерес обеспечивая точное общее число клеток (кратко в Рисунок 2 ). После того, как это достигается, и если все оптимизированные условия соблюдаются, контроль качества шаги могут быть удалены (чтобы сэкономить время – сохранение качества РНК и сокращение ячеек потери). Подтверждение успешной изоляции одной высокой жизнеспособности клеток из ткани интерес очень рекомендую перед любой вниз по течению обработки. 2) так как некоторые типы клеток более чувствительны, чем другие, чтобы подчеркнуть, чрезмерная разобщенность методы могут непреднамеренно смещения населения, поэтому смешанным течению анализа. Нежный диссоциации без ненужных сотовой стрижка и пищеварение имеет решающее значение для достижения высоких урожаев сотовой и точное представление о составе ткани. Сдвига происходят во время действия Тритурация, СУИМ и ресуспендирования. 3) как с любой работой РНК, лучше представить, как мало дополнительных РНКазы в выборку можно во время подготовки. Это будет способствовать поддержанию высокого качества РНК. Используйте решения Ингибитор рибонуклеазы с промывки чистые инструменты и оборудования, которое не является РНКазы бесплатно, но избежать DEPC-лечение продуктами. 4) выполняют подготовку как можно быстрее. Это поможет сохранить высокое качество РНК и уменьшить смерти клетки. В зависимости от длины рассечение тканей и животных номер рассмотреть возможность начала несколько Анатомирование/препараты в то же время. 5) Подготовьте клетки на льду, когда можно поддерживать высокое качество РНК, сократить гибель клеток и медленно ячейки сигнализации и транскрипционный анализ активности. Хотя, ледяной обработка идеально подходит для большинства типов клеток, некоторые типы клеток (например, нейтрофилов) работают лучше при обработке при комнатной температуре. 6) Избегайте кальция, магния, ЭДТА и DEPC-лечение продукты во время подготовки ячейки.
Этот протокол демонстрирует соответствующую подготовку одиночных клеток может раскрыть транскрипционный анализ гетерогенности тысячи одиночных клеток и дискриминацию функциональных состояний или уникальных сотовых тождества в ткани. Протокол не требует репортер флуоресцентные белки или трансгенных инструментов и может быть применен к изоляции одиночных клеток из различных тканей, представляющих интерес, в том числе от людей; Имея в виду каждая ткань уникальна, и этот протокол потребует определенной перестройки/модификации.
Разнообразных и весьма динамичный транскрипционный анализ программ внутри клетки подчеркивали значение одной ячейки геномики. Помимо изоляции высокого качества РНК, критических образца Подготовка шаг, необходимый для высокого качества наборов данных является обеспечение того, что клетки полностью освобождаются от ткани и клетки являются здоровыми и нетронутыми. Это довольно прямо вперед для сбора клеток, которые легко выпущена, например циркулирующих клеток или тканей, где слабо сохраняются клетки, такие как лимфоидной ткани. Но это может быть сложным для других взрослых тканях, благодаря высокоразвитой сотовой архитектуры, охватывающих большие расстояния, окружающих внеклеточного матрикса и часто жесткой цитоскелета белков, участвующих в поддержании клеточной структуры. Даже с соответствующим диссоциации методов для полного отпуска клеток есть потенциал, что строгие и часто продолжительной обработки требуется изменит качество и ячейки целостность мРНК. Кроме того высокие температуры, используемые для фермента помощь диссоциации также влияют на transcriptional подписей29,30. Целью протокола является в настоящее время контроль качества проверяет, используя ткани, такие как Миелинизированные нервные взрослых и внеклеточной матрицы богатых взрослых кожи, чтобы продемонстрировать, как оптимизация может помочь преодолеть эти препятствия.
Главным соображением при разработке любого эксперимента scRNA-Seq является выбор последовательности глубины. Последовательность может быть весьма мультиплексированием и читать глубина может варьироваться от очень низкий, с помощью Drop-Seq2 до 5 миллионов читает/ячейку14 полнометражных методом РНК-Seq как смарт-последующие Большинство scRNA-Seq эксперименты можно обнаружить умеренно высокий выражение стенограммы с последовательности как низко как 10 000 читает/клетки, которые обычно достаточно для ячейки типа классификации41,42. Глубина мелкой последовательности имеет значение сэкономить на стоимости последовательности при попытке обнаружить редкие клеточных популяций через сложные ткани, где тысячи клеток может потребоваться приписать уверенно редких населения. Но глубине последовательности не адекватные, когда необходима подробная информация о экспрессии генов и процессы, связанные с тонкими transcriptional подписей. В настоящее время предполагается, что большая часть генов в клетке обнаружены с 500.000 читает/клетки, но это может варьироваться в зависимости от протокола и ткани типа43,–44. Хотя полнометражного Стенограмма последовательности обходит необходимость сборки и может таким образом, обнаружить роман или редкие сращивания варианты, секвенирование расходы часто ограничивают масштабирования таких подходов для изучения тысяч клеток, включающий систему сложных тканей. В отличие от 3′ тегами одноклеточных библиотек такие, как те, указанных в настоящем Протоколе обычно ниже сложности и требуют меньшую последовательности. Важно отметить, что на одном из пяти поддерживаемых синтезаторов можно упорядочивать библиотеки, созданные с помощью описанных протокол: 1) NovaSeq, 2) HiSeq 3000/4000, 3) HiSeq 2500 быстрый запуск и высокий выход, 4) NextSeq 500/550 и 5) MiSeq.
Альтернативный подход к одной ячейке РНК-Seq, что снижает потребность в деликатных тканей и клеток, обработки еще не поддерживает некоторые из преимуществ одной ячейки РНК-Seq, является анализ РНК от одного ядра45. Этот подход позволяет более быстрой обработки, сокращения масштабов деградации РНК и более экстремальные меры для обеспечения надлежащего релиз ядра и таким образом вероятно позволяет более уверенно захвата транскрипционный анализ профилей, представляющий все ячейки в пределах данной ткани. Это конечно, только бы часть транскрипционный анализ деятельности в рамках данной ячейки, таким образом, в зависимости от того, каковы цели экспериментальных интерес этот подход может быть или не быть соответствующие.
Кроме полной характеристики сотовых самобытности в рамках данной ткани один из самых ценных анализов для scRNA-Seq наборов данных является оценка промежуточных транскрипционный анализ государств через «определенных» клеточных популяций. Эти промежуточные государства могут распространять идеи в линии связи между клетки внутри выявленных групп населения, которые не удалось с традиционными навалом, РНК-Seq подходов. Несколько scRNA-Seq bioinformatic инструменты были разработаны для выяснения этого. Такие инструменты могут оценить процессы, занимающиеся, например, раковые клетки, переходит к онкогенных/метастатического состояние, стволовые клетки, созревания в разнообразных терминала судьбы или иммунных клеток, курсируя между активным и покоя государствами. Транскриптом тонкие различия в клетках может также свидетельствовать о lineage предубеждения, что недавно разработанных bioinformatic инструменты, такие как FateID, может вывести47. Поскольку различия между переход клеток может быть трудным для выяснения учетом транскрипционный анализ различий может быть тонким, глубже последовательности может быть необходимым46. К счастью освещение неглубоко виртуализированного библиотеки может быть увеличена, если заинтересованы в зондирующего дальнейшего набора данных, повторно запустив библиотеке на другую ячейку потока.
Взятые вместе, этот протокол обеспечивает легко адаптировать рабочий процесс, который позволяет пользователям транскрипционно профиль сотни тысяч сингл клеток в пределах одного эксперимента. Конечное качество набора scRNA-Seq опирается на оптимизированные ячейки изоляции, проточной цитометрии, кДНК библиотеки поколения и интерпретации сырья ген штрих матриц. С этой целью этот протокол обеспечивает всесторонний обзор всех ключевых шагов, которые могут быть легко изменены для включения исследования тканей различных типов.
The authors have nothing to disclose.
Мы признаем вспомогательного персонала на объекте UCDNA услуг, а также животных уход сотрудников Фонда в Университете Калгари. Мы благодарим Matt Workentine за его поддержку биоинформатики и Йенс Durruthy его технической поддержки. Эта работа финансируется грантом КНИИЗ (р.м. и J.B.), КНИИЗ новую награду следователь J.B., и Альберта детей здоровья исследовательский институт стипендий (J.S.).
Products | |||
RNAse out | Biosciences | 786-70 | |
Pentobarbital sodium | Euthanyl | 50mg/kg | |
HBSS | Gibco | 14175-095 | |
Dispase 5U/ml | StemCell Technologies | 7913 | 5 mg/ml |
Collagenase-4 125 CDU/mg | Sigma-Aldrich | C5138 | 2 mg/ml |
DNAse | Sigma-Aldrich | DN25 | 10mg/ml |
BSA | Sigma-Aldrich | A7906 | |
15 ml Narrow bottom tube VWR® High-Performance Centrifuge Tubes | VWR | 89039-666 | |
Sytox Orange Viability Dye | Molecular Probes | 11320972 | 1.3 nM/µl |
Nuc Blue Live ReadyProbes | Invitrogen | R37605 | |
Agilent Bioanalyzer High senitivity DNA Reagents | Agilent | 5067-4626 | |
Kapa DNA Quantification Kit | Kapa Biosystems | KK4844 | |
Equipment | |||
BD FACSAria III | BD Biosciences | ||
Agilent Bioanalyzer Platform | Agilent | ||
Illumina® HiSeq 4000 | Illumina | ||
Illumina® MiSeq SR50 | Illumina | ||
Software | |||
The Cell Ranger | 10x GENOMICS | support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression | |
/software/overview/welcome | |||
Loupe Cell Browser | 10x GENOMICS | support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression | |
/software/downloads/latest | |||
R | https://anaconda.org/r/r |