Özet

Spatiotemporally controlado translocación Nuclear de los huéspedes en las células vivas utilizando colas Molecular enjaulados como etiquetas de Photoactivatable

Published: January 17, 2019
doi:

Özet

Este protocolo describe translocación nuclear activada por luz de huéspedes en las células vivas utilizando etiquetas enjaulado pegamento molecular. Este método es prometedor para la entrega de drogas dirigidas a nuclear sitio selectivo.

Abstract

El núcleo es uno de los orgánulos más importantes como objetivo subcelular-administración de fármacos, desde la modulación de la replicación de genes y expresión es eficaz para tratar diversas enfermedades. Aquí, demostramos enjaulado de translocación nuclear activada por la luz de los huéspedes que utilicen etiquetas pegamento molecular (enjauladopegamento-R), cuyos múltiples colgantes de ion (Gu+) Guanidinio están protegidos por un grupo de photocleavable aniónico (butirato-sustituido nitroveratryloxycarbonyl; BA NVOC). Los huéspedes etiquetados Cagedpegamento-R se toman en la vida las células mediante endocitosis y permanecer en endosomas. Sin embargo, en photoirradiation, Cagedpegamento-R se convierte en uncaged molecular pegamento (pegamento deUncaged-R) llevar varios colgantes de Gu+ , que facilita el escape endosomal y la subsecuente translocación nuclear de los invitados. Este método es prometedor para selectivo sitio nuclear contra entrega de la droga, ya que los invitados etiquetados pueden migrar en el citoplasma, seguido por el núcleo celular sólo cuando photoirradiated. Enjaulado Etiquetas cola-R pueden ofrecer a invitados macromoleculares como puntos cuánticos (QDs) así como huéspedes de moléculas pequeñas. Enjaulado Etiquetas cola-R pueden ser uncaged con luz UV, pero también dos fotones (NIR) la luz infrarroja, que puede penetrar profundamente en el tejido.

Introduction

El núcleo de la célula, que lleva la información genética, es uno de los orgánulos más importantes como objetivo subcelular-administración de fármacos, desde la modulación de la replicación de genes y expresión es eficaz para el tratamiento de varias enfermedades incluyendo el cáncer y genética trastornos1,2,3. Para nuclear entrega de medicamentos, Conjugación de péptidos etiquetas tales como localización nuclear (NLS) de señales4,5,6 ha sido ampliamente investigada. Sin embargo, para reducir efectos colaterales no deseados, es necesario el control espacio-temporal de la translocación nuclear.

Previamente, activadas por luz desplazamiento de proteínas en el núcleo celular se ha logrado utilizando jaulas NLS7,8,9. NLS emigra en el núcleo de la célula atando a transporte citoplásmico proteínas6. En los métodos divulgados, proteínas huésped teniendo enjaulados NLS directamente incorporadas en el citoplasma por microinyección8 o expresadas en las células diana mediante un código genético expansión técnica9. Por lo tanto, un método que puede lograr la absorción celular y translocación nuclear foto-inducida es ventajoso para aplicaciones prácticas.

Adjunto, describimos desplazamiento nuclear activada por la luz de los huéspedes en las células vivas utilizando etiquetas dendríticas pegamento molecular enjaulado (Cagedpegamento-R, figura 1). Pega molecular solubles en agua10,11,12,13,14,15,16,17,18 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23 cojinete varios colgantes de Gu+ se han desarrollado anteriormente que se adhieren firmemente a proteínas11,12,13,14,15, 16,17, los ácidos nucleic18,19,20, fosfolípido de las membranas21y arcilla nanosheets22,23 a través de la formación de múltiples puentes de sal entre sus colgantes de Gu+ y grupos oxyanionic en los objetivos. Los colgantes de Gu+ de Cagedpegamento-R están protegidos por un grupo de photocleavable aniónico, nitroveratryloxycarbonyl butirato-sustituido (BANVOC). Los huéspedes etiquetados Cagedpegamento-R se toman en la vida de las células mediante endocitosis y estancia en endosomas (figura 2). En photoirradiation, los grupos NVOC BAde Cagedpegamento-R son despegados para rendir un uncaged molecular pegamento (pegamento deUncaged-R) llevar varios colgantes de Gu+ , que luego facilita la migración de la huésped de etiquetado en el citoplasma, seguido por el núcleo de la célula (figura 2). La etiqueta de Cagedpegamento-R puede ser uncaged por la exposición a UV o dos fotones la luz de infrarrojo cercano (NIR) sin fototoxicidad grave. Demostramos la entrega nuclear spatiotemporally controlada de huéspedes macromoleculares como los huéspedes de molécula pequeña con las etiquetas de cola-R Caged, usando puntos cuánticos (QDs) y un colorante fluorescente (nitrobenzoxadiazole; Al siguiente día laborable), respectivamente, como ejemplos.

Figure 1
Figura 1: Estructuras esquemáticas del Cagedpegamento-R. Los colgantes de ion (Gu+) Guanidinio 9 de Cagedpegamento-R están protegidos por un grupo de nitroveratryloxycarbonyl butirato-sustituido (BANVOC). Los grupos NVOC BAson troceados por la irradiación con UV o luz NIR dos fotones. El núcleo focal de Cagedpegamento-R es functionalized con nitrobenzoxadiazole (NBD) o dibenzocylooctyne (DBCO). Reimpreso con el permiso de referencia20. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: Ilustración esquemática de translocación nuclear activada por la luz de los huéspedes conjugado con una etiqueta de Cagedpegamento-R. El invitado /Cagedconjugado de pegamento-R es tomado en la vida de las células mediante endocitosis. En photoirradiation, el Cagedpegamento-R es uncaged para obtener una etiqueta de pegamento-R Uncaged, que puede facilitar el escape endosomal de la huésped de etiquetado. Posteriormente, el huésped etiquetado emigra en el núcleo celular. Reimpreso con el permiso de referencia20. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Protocol

1. preparación de los huéspedes con pegamento-R enjauladoclave Preparar la solución de pegamento-NBD Caged. Sintetizar el Cagedpegamento-NBD (figura 1) siguiendo los procedimientos previamente descritos20. Preparar una solución stock de Cagedpegamento-al siguiente día laborable (10 mM) en seco de dimetilsulfóxido (DMSO).Nota: Almacene la solución en oscuridad. La solución puede diluir…

Representative Results

Antes de photoirradiation, células Hep3B incubadas con Cagedpegamento-NBD exhibieron emisión de fluorescencia punteado desde su interior (λext = 488 nm; Figuras 4A y 4C, verde). Una micrografía análogo se obtuvo con excitación a 543 nm para el rojo fluorescente tinte (figuras 4B y 4C, rojo), indicando que el Cagedpegamento-NBD localizada en los endosomas. E…

Discussion

Investigaciones anteriores de activadas por luz desplazamiento de proteínas en el núcleo celular se han logrado utilizando jaulas NLS7,8,9. Como se mencionó anteriormente, estos métodos requieren técnicas adicionales para incorporar las proteínas etiquetadas de NLS en el citoplasma. En cambio, nuestra etiqueta de pegamento-R Cagedpermite la translocación nuclear foto-inducida, sino también la absorción celula…

Açıklamalar

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Reconocemos el centro para la integración de NanoBio, la Universidad de Tokio. Este trabajo fue apoyado por subvenciones para jóvenes científicos (B) (26810046) K.O. y parcialmente financiado por subvenciones de investigación promovido especialmente (25000005) a T.A. R.M. gracias la becas de investigación de la sociedad de Japón para la promoción de la ciencia (JSPS ) para jóvenes científicos y el programa de líderes en las escuelas de posgrado (GPLLI).

Materials

Azide-PEG4-NHS ester Click Chemistry Tools AZ103
Q-dot 655 ITK Invitrogen Q21521MP
Regenerated cellulose membrane (MWCO 3,500) NIPPON Genetics TOR-3K
Regenerated cellulose membrane (MWCO 25,000) Harvard Apparatus 7425-RC25K
Hep3B Cells ATCC HB-8064
8-chambered glass substrate Nunc 155411JP
96-well culture plate Nunc 167008
Eagle's minimal essential medium (EMEM) Thermo Fisher Scientific 10370-021
Fetal bovine serum (FBS) GE Healthcare SH30406.02
Dulbecco's phosphate buffer saline (D-PBS) Wako Pure Chemical Industries 045-29795
LysoTracker Red Lonza Walkersville PA-3015
Hoechst 33342 Dojindo H342
Cell Counting Kit-8 Dojindo CK04
Confocal laser scanning microscope Carl-Zeiss LSM 510 Equipped with two-photon excitation laser (Mai Tai laser, Spectra-Physics)
Confocal laser scanning microscope Leica TCS SP8
Xenon light source Asahi Spectra LAX-102
Microplate reader Molecular Devices SpectraMax Paradigm

Referanslar

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Bu Makaleden Alıntı Yapın
Mogaki, R., Okuro, K., Arisaka, A., Aida, T. Spatiotemporally Controlled Nuclear Translocation of Guests in Living Cells Using Caged Molecular Glues as Photoactivatable Tags. J. Vis. Exp. (143), e58631, doi:10.3791/58631 (2019).

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