Qui descriviamo l’isolamento di cellule bursal primario di pollo da Borsa di Fabrizio, la cultura e l’infezione delle cellule con virus della bursite infettiva e la quantificazione della replicazione virale.
Virus della bursite infettiva (IBDV) è un birnavirus di importanza economica per il settore avicolo. Il virus infetta le cellule di B, causando morbilità, mortalità e immunosoppressione in volatili infetti. In questo studio, descriviamo l’isolamento di cellule bursal primario di pollo da Borsa di Fabrizio, la cultura e l’infezione delle cellule con IBDV e la quantificazione della replicazione virale. L’aggiunta di ligando di CD40 pollo ha aumentato significativamente la proliferazione delle cellule quattro volte su sei giorni di cultura e di attuabilità delle cellule significativamente migliorata. Due ceppi di IBDV, una coltura cellulare adattato ceppo, D78 e un ceppo molto virulento, UK661, replicato anche in colture cellulari ex vivo . Questo modello sarà di uso nel determinare come le cellule rispondere all’IBDV infezione e consentiranno una riduzione del numero di volatili infetti utilizzati negli studi di patogenesi IBDV. Il modello può anche essere ampliato per includere altri virus e potrebbe essere applicato a diverse specie di uccelli.
L’industria del pollame globale è essenziale per garantire cibo a sufficienza per una popolazione umana d’espansione. Tuttavia, l’immunosoppressione è la minaccia per la sicurezza alimentare e il benessere degli uccelli commoventi e rappresenta una sfida economica fondamentale per l’industria. La maggior parte dei casi di immunosoppressione nei polli è causata tramite l’infezione con virus immunosoppressivi, con i più responsabili di alterare la immunità acquisita avendo un tropismo per i linfociti T e B1. Negli uccelli, la maggior parte delle cellule B si trovano all’interno di un organo conosciuto come la borsa di Fabrizio (BF). Le cellule B sono suscettibili all’infezione con diversi virus immunosoppressivi, tra cui quelli che causano la lisi, come il virus della malattia di IBDV e di Marek (MDV) e quelli che causano la trasformazione, ad esempio virus Leucosi Aviarie (ALV) e Reticoloendoteliosi virus ( REV).
Al fine di sviluppare strategie più efficaci per il controllo di queste infezioni, è essenziale per caratterizzare l’interazione dei virus con pollo B cellule. Tuttavia, quando le cellule B vengono rimossi da un uccello, non sopravvivono bene in ex vivo cultura2, rendendo difficile per eseguire un’analisi approfondita delle interazioni di IBDV con pollo B celle o gli eventi precoci dopo l’infezione di ALV o REV. Di conseguenza, molte interazioni di virus-cellula ospite sono stati studiati in vivo3,4,5,6,7,8,9, 10. Anche se questi studi sono di carattere informativi, comportano l’uso di uccelli infetti che soffrono di malattie che possono essere gravi.
Il ligando di CD40 è una molecola che induce la proliferazione di cellule B11. A seguito di identificazione del pollo gene codifica CD40L (chCD40L), una proteina di fusione solubile è stata progettata che, quando aggiunto al terreno di coltura, ha indotto la proliferazione di pollo primaria B cellule ex vivo12. Nel 2015, coltivate in questo modo le cellule di B sono state trovate per supportare la replica di MDV2 e nel 2017, noi ed altri trovati che primarie bursal cellule stimolate con chCD40L potrebbero essere usate come modello per studiare IBDV replica13,14. Qui, descriviamo l’isolamento e coltura di cellule bursal primario di pollo, l’infezione delle cellule con IBDV e la quantificazione della replicazione virale. Anche se Descriviamo il metodo nel contesto del BF, questo potrebbe essere applicato alle cellule isolate e cultura da diversi organi linfoidi.
In questo studio, descriviamo la riuscita coltura di pollo cellule primarie bursal ex vivo in presenza di chCD40L solubile e dimostrare che queste cellule in grado di supportare la replica di un ceppo attenuato e un ceppo molto virulento di IBDV. Questo modello ex vivo può essere utilizzato per determinare come le cellule rispondono a un IBDV infezione13, che presenta chiari vantaggi rispetto agli studi in vivo e in vitro .
Durante la raccolta il BF, è fondamentale per non perforare l’intestino in modo da evitare la contaminazione batterica delle cellule bursal isolate. Inoltre, è importante isolare le cellule primarie più presto possibile dopo la raccolta dell’organo per limitare la morte delle cellule. La necessità di utilizzare chCD40L tratta di una limitazione della tecnica; Tuttavia, il lavoro condotto da Soubies et al. dimostra che l’uso di phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) per prolungare la vitalità cellulare bursal anziché chCD40L14 può attivare il modello essere adottato da un maggior numero di laboratori. Il protocollo di cui sopra determina la concentrazione ottimale di chCD40L empiricamente, coltivando cellule primarie di B in diluito serialmente concentrazioni della molecola e osservando la proliferazione delle cellule e vitalità. Per purificare la molecola di chCD40L e aggiungere una concentrazione specifica per terreni di coltura cellulare per evitare-lotto variabilità, potrebbe essere una potenziale modifica al protocollo.
In vivo gli studi hanno indicato che l’infezione IBDV seguente, che c’è un aumento nell’espressione di geni coinvolti nelle risposte di citochina pro-infiammatoria, risposte IFN di tipo I e apoptosi nel BF5,9,10 . Tuttavia, a seguito di infezione, c’è un afflusso delle cellule infiammatorie e cellule T effettrici in BF, che differiscono da nei geni che esprimono rispetto alla popolazione delle cellule B infettate9. È, pertanto, difficile da interpretare come infetta le cellule rispondono all’IBDV. Per risolvere questo problema, alcuni gruppi di ricerca hanno caratterizzato la risposta trascrizionale di cellule infettate con IBDV in cultura16,17,18,19,20. Questi studi in vitro hanno il vantaggio di MOIs ben definito e un postinfection di intervalli di tempo. Tuttavia, gli studi in vitro sono stati caratterizzati in genere in fibroblasti cellule16,17,20 o cellule dendritiche18. Mentre fornire qualche informazione sulle interazioni cellula-IBDV ospite, la convinzione corrente è che l’infezione delle cellule B è essenziale per la patogenesi di IBDV e, pertanto, la rilevanza dei dati non può essere overinterpreted. Prima del nostro ex vivo bursal modello della coltura cellulare, soltanto uno studio aveva caratterizzato la risposta cellulare delle cellule di B a IBDV infezione19; Tuttavia, questo studio ha utilizzato una linea di cellulari immortalizzate B che è stata trasformata a causa di infezione con ALV, limitando le conclusioni che potrebbero essere fatte. Al contrario, il modello ex vivo di infezione IBDV descritto qui permette ai ricercatori di mantenere i vantaggi degli studi in vitro , quali definiti MOIs e tempo-punti, mentre lo studio delle interazioni del virus con la cellula ospite pertinenti. Come le cellule bursal primarie sono ottenute da tessuti BF non infetti, ci sono non infiammatoria o cellule T presenti e noi abbiamo dimostrato di flusso cytometry (condizioni standard di utilizzo) che, dopo stimolazione chCD40L, 97% della popolazione cellulare è positivo per l’indicatore di cella B Bu-1 (dati non mostrati). Dato che il 3% delle cellule sono Bu-1 negativo, sarà interessante determinare se queste cellule infettano con IBDV ed esplorare la loro espressione genica e contributo alla patogenesi.
Prevediamo che il modello di cultura ex vivo bursal primario delle cellule di pollo può essere espanso per studiare le interazioni virus-cellula ospite di altri virus tropici della B-cellula che infetta polli, ad esempio ALV o REV e potrebbe anche essere ampliato ad altre specie avicole ( ad esempio, anatre o tacchini). La capacità di coltura primaria bursal cellule ex vivo anche apre la possibilità di studiare aspetti della patogenesi e dell’immunosoppressione causate da questi virus senza la necessità di infettano gli uccelli. Come in vivo studi causano la morbosità significativa, questo avrà un impatto sostanziale sulla sostituzione, raffinatezza e la riduzione dell’uso di animali nella ricerca.
In sintesi, la cultura di bursal primario delle cellule ex vivo pollo modello qui descritto ha il potenziale per espandere la comprensione della B-cellula come aviaria virus tropici interagire con le cellule dell’ospite, riducendo il numero di uccelli utilizzati in vivo in studi di infezione. Le tecniche possono essere applicate a più organi linfoidi, più virus e, potenzialmente, più specie di uccelli, che lo rende un modello attraente che può contribuire per i campi di virologia e immunologia aviaria.
The authors have nothing to disclose.
Gli autori vorrei ringraziare il team di Animal Services presso l’Istituto di Pirbright per le loro competenze in cova, allevamento e l’abbattimento di uccelli e la competenza di Caroline Holt nel rimuovere asetticamente la borsa di Fabrizio. A.B. è finanziato attraverso la biotecnologia e Biological Sciences Research Council (BBSRC) via concede BBS/E/I/00001845, K.D. è finanziato attraverso il BBSRC via studentship BBS/E/I/00002115, e A.A. è finanziato attraverso il centro nazionale per la Sostituzione, affinamento e riduzione degli animali nella ricerca (NC3Rs) via concedere NC/R001138/1.
RPMI-1640 Medium | Merck | R8758-500ML | |
FBS | gibco by Life Technologies | 10099-141 | heat-inactivate at 56°C for 1 hour |
Puromycin Dihydrochloride | Thermo Fisher Scientific | A1113802 | |
Nalgene Rapid-Flow Sterile Disposable Filter with a PES membrane | Thermo Fisher Scientific | 168-0045 | |
Pierce Protein Concentrator PES (10K MWCO, 20ml) | Thermo Fisher Scientific | 88528 | |
0.22µm Millex-GP Syringe Filter | Merck | F7648 | |
Hanks' Balanced Salt Solution (HBBS) + CaCl2 + MgCl2 | gibco by Life Technologies | 14060-040 | |
Hanks' Balanced Salt Solution (HBBS) – CaCl2 – MgCl2 | gibco by Life Technologies | 14180-046 | |
Ethylenediaminetetraacetic acid solution (EDTA) | Merck | 03690-100ML | |
Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM) (1 X) + GlutaMAX | gibco by Life Technologies | 31980-030 | |
Chicken Serum | Merck | C5405-100ML | |
2-Mercaptoethanol 50mM | gibco by Life Technologies | 31350-010 | |
insulin-transferrin-sodium-selenite | gibco by Life Technologies | 41400-045 | |
Collagenase D | Roche Diagnostics GmbH | 11088882001 | |
100µm Cell Strainer | Corning | 431752 | |
Histopaque-1083 | Merck | 10831-100ML | |
Trypan Blue solution | Merck | T8154-20ML | |
Nunc96 Well-Polystyrene Round Bottom Microwell Plates | Thermo Fisher Scientific | 163320 | |
Falcon 24-well Clear Flat Bottom TC-treated Multiwell Cell Culture Plate, with Lid, Sterile | Corning | 353047 | |
Rneasy Mini Kit | Qiagen | 74104 |