Ici, nous décrivons l’isolement de cellules bursite primaires de poulet de la bourse de Fabricius, la culture et l’infection des cellules par le virus de la bursite infectieuse et la quantification de la réplication virale.
Virus de la bursite infectieuse (IBDV) est un virus d’importance économique pour l’industrie de la volaille. Le virus infecte les lymphocytes B, causant de la morbidité, la mortalité et l’immunosuppression chez les oiseaux infectés. Dans cette étude, nous décrivons l’isolement de cellules bursite primaires de poulet de la bourse de Fabricius, la culture et l’infection des cellules avec IBDV et la quantification de la réplication virale. L’ajout du ligand CD40 poulet a augmenté significativement la prolifération cellulaire quatre fois plus de six jours de culture et de la viabilité cellulaire nettement améliorée. Deux souches de IBDV, une culture cellulaire adapté de souche, D78 et une souche très virulente, UK661, reproduit bien dans les cultures de cellules ex vivo . Ce modèle sera d’utilité pour déterminer comment les cellules répondent à l’infection IBDV et permettront une réduction du nombre d’oiseaux infectés utilisés dans les études de pathogenèse IBDV. Le modèle peut également être étendu aux autres virus et pourrait être appliqué à différentes espèces d’oiseaux.
L’industrie avicole mondiale est essentielle pour garantir suffisamment de nourriture pour une population humaine en expansion. Toutefois, l’immunosuppression est la menace à la sécurité alimentaire et le bien-être des oiseaux touchés et représente un défi économique majeur à l’industrie. La majorité des cas d’immunosuppression chez les poulets est causée par l’infection avec le virus immunosuppresseurs, avec les plus responsables de l’immunité acquise ayant un tropisme pour de lymphocytes T et B1une atteinte. Chez les oiseaux, la majorité des cellules B est située dans un organe appelé la bourse de Fabricius (BF). Les cellules B sont susceptibles d’être infectées par plusieurs virus immunosuppresseurs, y compris ceux qui provoquent la lyse, comme le virus de la maladie IBDV et de Marek (MDV) et ceux qui causent la transformation, telles que les virus de la leucose aviaire (ALV) et (Réticuloendothéliose) virus REV).
Afin de développer les meilleures stratégies pour contrôler ces infections, il est essentiel pour caractériser l’interaction des virus avec des cellules de poulet B. Toutefois, lorsque les cellules B sont supprimés d’un oiseau, ils ne survivent pas bien l’ex vivo culture2, rendant difficile d’effectuer une analyse approfondie des interactions entre les IBDV avec des cellules de poulet B, ou les événements tôt après l’infection ALV ou REV. En conséquence, beaucoup d’interactions virus-cellules hôte ont été étudiés en vivo3,4,5,6,7,8,9, 10. Bien que ces études sont informatifs, ils impliquent l’utilisation d’oiseaux infectés qui souffrent de maladies qui peuvent être graves.
Le ligand de CD40 est une molécule qui induit la prolifération de lymphocytes B11. Après identification de la poule de codage de gène CD40L (chCD40L), une protéine de fusion soluble a été conçue que, lorsqu’on ajoute les milieux de culture, induit la prolifération de poulet primaire B cellules ex vivo12. En 2015, les cellules B cultivées de cette façon ont été trouvés pour soutenir la réplication de MDV2 et en 2017, nous et autres découvre que des cellules primaires de bursite stimulées avec chCD40L peuvent être utilisés comme modèle pour étudier IBDV réplication13,14. Ici, nous décrivons l’isolement et de culture de cellules primaires bursite de poulet, l’infection des cellules avec IBDV et la quantification de la réplication virale. Bien que nous décrire la méthode dans le contexte de la BF, cela pourrait s’appliquer aux cellules de souche et de la culture de différents organes lymphoïdes.
Dans cette étude, nous décrire la culture réussie de poulet des cellules primaires de bursite ex vivo en présence de chCD40L soluble et démontrer que ces cellules peuvent prendre en charge la réplication d’une souche atténuée et une souche très virulente de IBDV. Ce modèle ex vivo peut être utilisé pour déterminer la façon dont les cellules réagissent à une IBDV infection13, qui a des avantages distincts sur des études in vivo et in vitro .
Lorsqu’ils pêchent la BF, il est essentiel de ne pas perforer l’intestin afin d’éviter la contamination bactérienne de cellules isolées des bursite. En outre, il est important d’isoler les cellules primaires dès que possible après la récolte de l’orgue pour limiter la mort cellulaire. La nécessité d’utiliser des chCD40L est une limitation de la technique ; Toutefois, les travaux menés par Soubies et coll. montre que l’utilisation de phorbol 12-myristate 13-acétate (PMA) pour prolonger la viabilité cellulaire bursite au lieu de chCD40L14 peut activer le modèle à adopter par un plus grand nombre de laboratoires. Le protocole décrit ci-dessus détermine la concentration optimale de chCD40L empiriquement, en cultivant des cellules de B primaires dans des concentrations en série diluées de la molécule et observation la prolifération cellulaire et la viabilité. Une modification éventuelle du protocole pourrait être de purifier la molécule de chCD40L et d’ajouter une concentration spécifique pour les milieux de culture cellulaire afin d’éviter la variabilité à lot.
Des études in vivo ont montré que l’infection IBDV suivante, qu’il y a une augmentation de l’expression des gènes impliqués dans des cytokines pro-inflammatoires, les réponses de Type I IFN et l’apoptose dans le BF5,9,10 . Cependant, suite à une infection, il y a un afflux de cellules inflammatoires et des cellules effectrices T dans le BF, qui diffèrent dans les gènes qu’ils expriment par rapport à la population de cellules B infectées9. Par conséquent, il est difficile à interpréter comment infecté les cellules réagissent à IBDV. Pour y remédier, certains groupes de chercheurs ont caractérisé la réponse transcriptionnelle de cellules infectées par IBDV dans culture16,17,18,19,20. Ces études in vitro ont l’avantage de month bien définis et -points dans le temps après l’infection. Toutefois, des études in vitro ont généralement été caractérisés dans des fibroblastes cellules16,17,20 ou cellules dendritiques18. Tout en donnant un aperçu des interactions cellule-IBDV hôte, la croyance actuelle est que l’infection des cellules B est cruciale à la pathogenèse de la IBDV et, par conséquent, la pertinence des données ne peut pas être overinterpreted. Avant notre ex vivo bursite modèle de culture cellulaire, une seule étude a qualifié la réaction cellulaire des cellules B à IBDV infection19; Cependant, cette étude a utilisé une lignée de cellules de B immortalisées qui a été transformée en raison de l’infection par ALV, limitant les conclusions qui pourraient être apportées. En revanche, le modèle ex vivo de l’infection IBDV décrite ici permet aux chercheurs de conserver les avantages des études in vitro , tels que définis month et points dans le temps, tout en étudiant les interactions du virus avec la cellule hôte pertinentes. Comme les cellules primaires de bursite sont obtenus à partir des tissus sains de BF, il n’y a aucun inflammatoire ou cellules T présentes et nous avons démontré par cytométrie en flux (en utilisant les conditions standard) qui, après la stimulation chCD40L, 97 % de la population cellulaire est positif pour le marqueur de cellules B Bu-1 (données non présentées). Étant donné que 3 % des cellules sont Bu-1 négatif, il sera intéressant de déterminer si ces cellules deviennent infectées avec IBDV et explorent leur expression des gènes et leur contribution à la pathogénèse.
Nous prévoyons que le modèle de culture cellulaire bursite primaire ex vivo poulet peut aussi être étendu afin d’étudier les interactions virus-cellules hôte d’autres virus tropiques de B-cellule infectant les poulets, comme ALV ou REV et pourrait également être étendu aux autres espèces aviaires ( par exemple, des canards ou dindes). La capacité à la culture des cellules primaires de bursite ex vivo aussi ouvre la possibilité d’étudier divers aspects de la pathogénie et l’immunosuppression provoquée par ces virus sans avoir besoin d’infecter les oiseaux. Des études in vivo provoquer une morbidité importante, cela aura un impact considérable sur le remplacement, le raffinement et la réduction de l’utilisation des animaux dans la recherche.
En résumé, l’ex vivo poulet primaire bursite modèle de culture cellulaire décrit ici a le potentiel pour approfondir la connaissance de B-cellule comment aviaire virus tropiques interagissent avec les cellules de l’hôte tout en réduisant le nombre d’oiseaux utilisés dans in vivo études d’infection. Les techniques peuvent s’appliquer à plusieurs organes lymphoïdes, plusieurs virus et, éventuellement, plusieurs espèces d’oiseaux, ce qui en fait un modèle attrayant qui peut contribuer aux champs de virologie et d’immunologie aviaires.
The authors have nothing to disclose.
Les auteurs tiennent à remercier l’équipe des Services de l’Animal à l’Institut de Pirbright pour leur expertise dans l’éclosion, l’élevage et abattage des oiseaux et l’expertise de Caroline Holt dans aseptiquement supprimant la bourse de Fabricius. A.B. est financé par le biais de la biotechnologie et Biological Sciences Research Council (BBSRC) via accorde BBS/E/I/00001845, K.D. est financé par le BBSRC via stagiaire BBS/E/I/00002115, et A.A. est financé par le Centre National pour la Remplacement, de raffinement et de réduction des animaux en recherche (NC3Rs) via accordent NC/R001138/1.
RPMI-1640 Medium | Merck | R8758-500ML | |
FBS | gibco by Life Technologies | 10099-141 | heat-inactivate at 56°C for 1 hour |
Puromycin Dihydrochloride | Thermo Fisher Scientific | A1113802 | |
Nalgene Rapid-Flow Sterile Disposable Filter with a PES membrane | Thermo Fisher Scientific | 168-0045 | |
Pierce Protein Concentrator PES (10K MWCO, 20ml) | Thermo Fisher Scientific | 88528 | |
0.22µm Millex-GP Syringe Filter | Merck | F7648 | |
Hanks' Balanced Salt Solution (HBBS) + CaCl2 + MgCl2 | gibco by Life Technologies | 14060-040 | |
Hanks' Balanced Salt Solution (HBBS) – CaCl2 – MgCl2 | gibco by Life Technologies | 14180-046 | |
Ethylenediaminetetraacetic acid solution (EDTA) | Merck | 03690-100ML | |
Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM) (1 X) + GlutaMAX | gibco by Life Technologies | 31980-030 | |
Chicken Serum | Merck | C5405-100ML | |
2-Mercaptoethanol 50mM | gibco by Life Technologies | 31350-010 | |
insulin-transferrin-sodium-selenite | gibco by Life Technologies | 41400-045 | |
Collagenase D | Roche Diagnostics GmbH | 11088882001 | |
100µm Cell Strainer | Corning | 431752 | |
Histopaque-1083 | Merck | 10831-100ML | |
Trypan Blue solution | Merck | T8154-20ML | |
Nunc96 Well-Polystyrene Round Bottom Microwell Plates | Thermo Fisher Scientific | 163320 | |
Falcon 24-well Clear Flat Bottom TC-treated Multiwell Cell Culture Plate, with Lid, Sterile | Corning | 353047 | |
Rneasy Mini Kit | Qiagen | 74104 |