在这里, 我们提出了一个方案, 用于制备富含琼脂的人精确切肺切片从切除的患者组织, 适合产生三维肺组织培养, 以模拟人类肺部疾病的生物和生物医学研究。
人类基于组织的疾病模型的存在限制了人类疾病新发现的翻译。精确切割肺切片 (pcls) 用作三维肺组织培养物 (3d-ltc), 是一种优雅且具有高度生物相关性的三维细胞培养模型, 由于其复杂性、生物力学性和分子性, 与原位组织非常相似组成。组织切片在各种动物模型中得到了广泛的应用。从人类 pcls 中提取的3D-LTCs 可用于分析对新型药物的反应, 这可能有助于更好地了解药物在人体组织中的机制和功能效应。从经过肺叶切除术的肺组织标本中制备 pcls, 增加了病变和口腔组织的可及性。在这里, 我们描述了一个详细的方案, 以生成人类 pcls 从手术切除的软弹性患者肺组织。琼脂糖被引入到直肠的支气管肺泡空间中, 从而保持了肺结构, 增加了组织的刚度, 这对随后的切片至关重要。从组织块中制备了500μm 厚的切片, 并具有振动。从 pcls 中提取的活检冲孔可确保可比较的组织样本大小, 并进一步增加组织样本的数量。所产生的肺组织培养可应用于人类肺生物学的各种研究, 包括不同疾病的病理生理学和机制, 如在 (亚) 细胞水平上的最佳纤维化过程。3d-ltc体外模型的最大优点是它在三维组织结构、细胞类型多样性和肺解剖方面对原位人体肺的近距离表示, 以及从个别患者中评估组织的潜力。是相关的进一步发展新的策略的精密医学。
慢性和急性肺病是全世界发病率和死亡率的主要原因1。对于慢性肺病患者, 如阻塞性肺病 (copd)2、重症哮喘3、肺癌4和弥漫性实质肺病5, 目前尚不具备治疗疗法。虽然对肺病动物模型的研究加深了对疾病病理机制的了解, 但也导致了潜在的新治疗目标7、8、9 的确定。与人类相比, 这些模型表现出相关的生物和生理差异10。为了克服小鼠与人体生物学以及解剖学之间的差异, 人体外三维肺组织培养 (3d-ltc) 系统被用于生物医学研究的各个领域。这些3d-ltc 培养系统是基于精确切割肺切片 (pcls)。通过在体内生成 pcls, 可以分析第三个空间维度, 从而可以调查整个肺泡和气道11中细胞的空间和功能关系, 以及间质、血管和间皮。值得注意的是, pcls 体外模型是多细胞的, 这意味着它们包含了原位肺的大多数功能细胞, 从而密切代表了细胞的原始生物环境, 从而克服了大多数2d 中有限的细胞细胞和细胞基质相互作用细胞培养的方法。到目前为止, 体内小鼠 pcls 被用来模拟肺部疾病, 如 copd12, 肺纤维化13, 肺癌 14,病毒感染15,16, 支气管肺发育不良17, 和哮喘18。然而, 在临床试验中调查的相当一部分人类肺病新药治疗并没有转化为临床, 因为它们缺乏疗效或安全性, 令人惊讶的是, 由于人类与人类之间尚未存在相当大的差异。小鼠生物学和疾病19,20,21。
几年来, 人类 pcls 主要用于评估化学品和药物的肺毒性。直到最近, 人类肺组织才被用于慢性阻塞性肺病22,23, 哮喘24和肺纤维化25, 以进行病理生理学和药理研究。通过使用切除的患者器官材料并生成其 pcls, 可以在一个复杂的三维组织环境22中重述主要疾病的特征 , 代表和维持器官的大部分本地细胞多样性。此外, 在各种实验设置中应用的病变组织被证明是模拟肝脏、肠道和肾脏的疾病样变化 26,27,28,29。
然而, 肺组织的处理仍然具有挑战性, 原因有几个。与固体组织不同的是, 本地肺实质体往往在没有通气的情况下塌陷, 并表现出较低的组织刚度。这些特性阻碍了组织的切片。因此, 气道和肺泡空间的填充与低熔点琼脂糖保留了本地肺结构, 并提供了所需的刚度, 精确切割切片的小鼠和人的肺 30.人类为研究目的捐赠的肺切除物本质上是解剖、遗传和生理上高度多样化的, 因此在进行实验25时往往表现出很高的患者间变异性。与整个肺叶或整个肺外植体不同的是, 通过胸外科切除的肺样本不一定遵循解剖段, 因此需要特殊的准备。在本文中, 我们提供了一个详细和优化的方案, 以产生人类 pcls 从切除的肺组织, 并随后种植和实验使用模型肺病。
本手稿中描述的协议包括从人类肺组织切除物中生成 pcls, 方法是将其填充液体琼脂糖和随后的振动体切片。组织切片的生成之前被证明为一对夫妇的器官, 如肝脏和大脑, 而这些器官固有的刚度允许直接切片, 而无需对组织进行任何修改。值得注意的是, 肺组织的初始适当准备是产生 pcls 的最关键步骤。肺的琼脂糖填充是稳定其柔软和弹性的方法, 并确保均匀和可重复的 pcls 生成。切除的肺组织的大气道管 , 以提供进入小气道的通道 , 以及完整的肺实质。缺乏完整的胸膜, 这使得琼脂糖填充几乎不可能, 是肺组织大多不能用于肺切片的主要原因。前瞻性地, 一种原本设计用于在脱细胞支架上进行功能实验的合成胸膜有可能被用于成功地充填缺乏完整胸膜31的外植体。切除导致人类肺组织片与完整的胸膜是必不可少的产生组织块切片。切除的组织比接受肺移植的患者完全完整的裂片或全肺外植体更容易获得癌症切除引起的肿瘤无肿瘤组织。
通常, 有两个系统用于生产 pcls: krumdieck 组织切片器15和振动微瘤 (振动体)。组织切片器通过通过金属容器传递组织块生成切片, 金属血管在这个容器的末端以90°的速度切割 pcls。振动体通过在浸没在冷却介质浴中的固定组织块上水平移动振动刀产生 pcls, 与 krumdieck 切割机相比, 它对组织的剪切力较小。这导致培养前对组织的处理不那么苛刻。另一方面, 振动模切割是更多的时间和工作消耗。在我们手中, 振动体切片能够在一天内最多生产 100个 pcls 或 500个 pcls 冲孔, 足以用于大多数实验研究。pcls 可以通过各种方式进行培养: (a) 附着在跨井上, 从而产生空气液体界面 (ali) 系统, (b) 作为动态器官培养 (doc), 或 (c) 在标准细胞培养条件下淹没在细胞培养培养基中。pcls 的详细培养以前描述过22,23,25;然而, 它们在世界各地的各种实验室的使用之间的共同种植条件标准仍然缺失。特别是, 培养时间可能是关键的: 在小鼠 pcls 中, sftpc 阳性肺泡型2细胞在144小时后, 但不是在 120h22后, 就会丢失。此外, 在22小鼠和人类 pcls25中, 代谢活动似乎保持稳定, 时间为120小时。
pcls 的产生有几个技术限制: 直肠的数量和大小会随着时间的推移而波动;琼脂糖填充的效率取决于所获得组织中是否存在完整的胸膜, 决定了 pcls 生成的最终成功;所获得的 (患病) 肺组织内的病理改变所造成的组织破坏可能会干扰 pcls 的制备。气道阻塞和缺乏完整肺泡空间的纤维化组织阻碍琼脂糖充盈, 从而使纤维化组织切片成为一项艰巨的任务。在慢性阻塞性肺病或α-1-抗胰蛋白酶缺乏症等疾病中发现的肺气肿组织可能经不起琼脂糖填充的压力, 并将导致肺泡和建筑文物破裂。在这些情况下, 使用低琼脂糖浓度, 例如 1% ( w v), 可能有助于降低琼脂糖灌装过程中的压力和速度。总体而言, 组织的疾病状态会极大地限制组织在 pcls 生成中的使用。所有这些参数决定了可以从肺组织中产生的 pcls 的数量, 以及产生 pcls 所需的时间。pcls 的进一步限制是不同肺切片在大小或组织含量方面的不一致, 这就需要进一步的规范化实验步骤。为了克服这种情况, 可以产生同一切片类似区域的活检拳。此过程容易减少组织的变异性, 并作为一个额外的好处, 增加可用于实验的 pcls 样本的数量。
总之, 人类三维肺组织培养从琼脂糖填充 pcls 为研究肺生理和疾病提供了一个复杂的人类模型。该协议详细介绍了从切除的肺组织中制备 pcls 的方法及其培养, 并解决了琼脂糖填充人体肺切除的挑战以及如何克服这些挑战。
The authors have nothing to disclose.
提交人感谢 marisa neumann 提供的专家技术援助。所有肺组织均由 cpc-m 生物档案提供。这项工作得到了德国肺研究中心 (dzl)、赫尔姆霍兹协会和 cpc 研究学校赠款的支持。
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