Aqui, apresentamos um protocolo para a preparação de fatias de cheias de agarose humano pulmão de precisão de corte de tecido ressecado de pacientes que são adequados para a geração de culturas de tecido de pulmão 3D para doenças de pulmão humano modelo em estudos biológicos e biomédicos.
Tradução do romance descobertas a doença humana é limitada pela disponibilidade de modelos baseados em tecidos humanos da doença. Pulmão de precisão de corte fatias (PCLS) utilizado como culturas de tecido de pulmão 3D (3D-CTIs) representam um elegante e modelo de cultura de células 3D biologicamente altamente relevantes, que se assemelham a altamente tecido no local devido à sua complexidade, biomecânica e molecular composição. Corte o tecido é aplicado extensamente em vários modelos animais. 3D-CTIs derivados PCLS humana podem ser usados para analisar as respostas a novos medicamentos, o que mais podem ajudar a compreender melhor os mecanismos e efeitos funcionais de drogas em tecidos humanos. A preparação de PCLS de amostras de tecido pulmonar cirurgicamente ressecado de pacientes, que experimentaram a lobectomia pulmonar, aumenta a acessibilidade dos doentes e tecido de natureza. Aqui, descrevemos um protocolo detalhado para a geração de PCLS humana do tecido pulmonar de pacientes cirurgicamente ressecado macio-elástica. Agarose foi introduzido no espaço de lavado broncoalveolar a resectates, assim preservando a estrutura pulmonar e aumento da rigidez do tecido, que é crucial para fatiar subsequentes. 500 µm de espessura foram preparadas a partir do bloco de tecido com um vibratome. Socos de biópsia retirados PCLS garantir comparável tecido tamanhos de amostra e aumentam ainda mais a quantidade de amostras de tecido. As culturas de tecido de pulmão gerado pode ser aplicadas em uma variedade de estudos em biologia de pulmão humano, incluindo a fisiopatologia e mecanismos de doenças diferentes, tais como processos fibróticos em seus níveis de celulares melhores no (sub-). O maior benefício do modelo ex vivo de 3D-LTC é sua representação perto do pulmão humano in situ em relação a arquitetura do tecido 3D, diversidade de tipo de célula e anatomia do pulmão, bem como o potencial para a avaliação do tecido de pacientes individuais, que é relevante para continuar a desenvolver novas estratégias para a medicina de precisão.
Doenças pulmonares crônicas e agudas são das principais causas de morbidade e mortalidade em todo o mundo1. Para pacientes com doenças pulmonares crônicas, como doença pulmonar obstrutiva (DPOC)2, asma grave3, câncer de pulmão4 e de doenças pulmonares parenquimatosas difusas5, terapias curativas atualmente não estão disponíveis. Embora estudos em modelos animais de doenças pulmonares aprofundaram a compreensão da doença pathomechanisms6 e conduziram à identificação de potenciais novos alvos terapêuticos7,8,9, Estes modelos apresentam diferenças biológicas e fisiológicas relevantes quando comparado com os humanos10. Para superar estas discrepâncias entre biologia murino e humana, bem como a anatomia, humana ex vivo cultura do tecido de pulmão 3D (3D-LTC) sistemas são utilizados em diversas áreas de investigação biomédica. Estes sistemas de cultura 3D-LTC baseiam-se em fatias de precisão de corte de pulmão (combustível). A geração de PCLS ex vivo permite a análise de uma terceira dimensionalidade espacial, que permite a investigação das relações espaciais e funcionais de células em toda alvéolos e vias aéreas11, bem como o interstício, vascularização e mesotélio. Notavelmente, PCLS ex vivo modelos são pluricelulares, significando que eles contêm células mais funcionais dos pulmões no local, representando assim pròxima ambiente biológico nativo das células e assim superar o limitado célula-célula e interação célula-matriz em 2D mais abordagens de cultura de células. Até agora, ex vivo PCLS murino foram usadas para modelar doenças pulmonares, como a DPOC12, pulmão fibrose13, câncer de pulmão14, infecção viral15,16, de displasia broncopulmonar17, e asma,18. No entanto, uma proporção considerável de terapias de droga romance em doenças de pulmão humano que foram investigadas em ensaios clínicos não traduzir para a clínica devido à sua falta de eficácia ou segurança, assumingly devido a ainda consideráveis diferenças entre humanos e murino biologia e doença19,20,21.
Ao longo de vários anos, PCLS humanas têm sido largamente utilizados para avaliar a toxicidade pulmonar de produtos químicos e drogas. Apenas recentemente, tecido pulmonar humano tem sido utilizado em pacientes com DPOC22,23, asma24e de fibrose pulmonar25, para prosseguir estudos fisiopatológicos e farmacológicos. Usando o material ressecado órgão doente e gerando PCLS, um pode recapitular características das principais doenças em um tecido complexo 3D ambiente22 representando e mantendo a maioria da diversidade celular nativa do órgão. Além disso, mostrou-se tecido doente, aplicado em uma variedade de configurações experimentais para imitar a doença, como alterações no fígado, intestino e rim26,,27,28,29.
No entanto, o processamento do tecido pulmonar permanece desafiador por várias razões. Ao contrário de tecido sólido, parênquima pulmonar nativa tende a entrar em colapso sem ventilação e exibe baixa rigidez do tecido. Essas propriedades impedem o corte do tecido. Assim, o enchimento de vias aéreas e o espaço alveolar com baixo ponto de fusão ponto de agarose preserva a estrutura do pulmão nativo e fornece a rigidez necessária para precisão de corte, corte de murino e humano pulmões30. Resectates de pulmão humano doados para fins de pesquisa são por sua natureza anatomicamente, geneticamente e fisiologicamente altamente diversificada, assim, muitas vezes apresentando uma alta variabilidade inter paciente ao realizar experimentos25. Em contraste com o lobo inteiro ou todo pulmão explantes, amostras de pulmão ressecadas por meio de cirurgia torácica não necessariamente seguir os segmentos anatômicos e, portanto, exigem preparação especial. Neste artigo, nós fornecemos um protocolo detalhado e otimizado para a geração de PCLS humana do tecido pulmonar ressecado e sua subsequente cultivo e uso experimental para doença pulmonar de modelo.
O protocolo descrito neste manuscrito abrange a geração de combustível de resectates de tecido de pulmão humano enchendo-o com líquido agarose e subsequente vibratome corte. Geração de fatias de tecido foi demonstrada antes por um par de órgãos, como fígado e cérebro, Considerando que a rigidez inerente destes órgãos autorizados direta de corte sem nenhuma modificação do tecido. De nota, a correcta preparação inicial do tecido pulmonar é a etapa mais crucial na geração de combustível. Enchimento de agarose do pulmão é o método de escolha para estabilizar sua natureza macia e elástica e para garantir uma geração de PCLS homogénea e reprodutível. Grandes vias aéreas do tecido pulmonar ressecado são canuladas para fornecer acesso às pequenas vias aéreas, bem como o parênquima pulmonar intacto. A falta de uma pleura intacta, que agarose enchimento torna quase impossível, é das principais razões porque o tecido pulmonar principalmente não é utilizável para corte de pulmão. Prospectivamente, um sintético pleura originalmente projetado para realizar experiências funcionais em andaimes decellularized potencialmente poderia ser aplicada para alcançar o sucesso agarose enchimento de explantes que falta uma pleura intacta31. Ressecções, resultando em um pedaço de tecido de pulmão humano com pleura intacta são essenciais para a geração de blocos de tecido para cortar. Tecido ressecado é mais disponível devido ao tecido livre de tumor de resseção de câncer do que lobos totalmente intactos ou explantes todo-pulmão de pacientes submetidos a transplante de pulmão.
Comumente, dois sistemas são usados para produzir combustível: o Krumdieck tecido fatiador15 e micrótomos vibratórios (vibratomes). Segmentações de dados tecido geram fatias passando um bloco de tecido através de um vaso de metal, que corta o combustível a 90° no final deste navio. Vibratomes gerar PCLS movendo uma vibração faca horizontalmente sobre um bloco ancorado de tecido que está submersa em um banho médio refrigerado, que em comparação com o cortador de Krumdieck exerce menos força de cisalhamento sobre o tecido. Isso resulta em menos tratamento severo do tecido antes de cultivo. Por outro lado, a corte de vibratome é mais tempo e trabalho consumindo. Em nossas mãos, vibratome corte permitiu a produção de um máximo de 100 PCLS ou 500 PCLS socos em um dia, suficiente para estudos mais experimentais. PCLS pode ser cultivado de várias formas: (a) anexado ao Trans-poços, gerando assim uma interface líquido ar sistema (ALI), (b) como cultura órgão dinâmico (DOC), ou (c) submerso em meio de cultura celular em condições de cultura celular padrão. O cultivo em detalhes de PCLS foi descrito anteriormente22,23,25; no entanto, um padrão comum de condições de cultivo entre seu uso em vários laboratórios ao redor do mundo ainda está desaparecido. Em particular, o tempo de cultura pode ser crítico: como PCLS murino, uma perda de células do tipo alveolar positiva 2 SFTPC é observada após 144 h, mas não após 120 h22. Além disso, atividade metabólica parece permanecer estável em22 de murino e humano PCLS25 para 120 h.
Há um par de limitações técnicas para a geração de combustível: o número e o tamanho da resectates varia ao longo do tempo; a eficiência da agarose de enchimento, que depende da presença da pleura intacto dentro do tecido obtido, determina o sucesso final da geração PCLS; e destruição tecidual causada por alterações patológicas dentro do tecido pulmonar (doentes) obtidos pode interferir com a preparação de motores. Obstruções das vias aéreas e tecido fibrótico falta espaço alveolar intacto impedem com enchimento de agarose e, assim, fazem o corte do tecido fibrótico uma tarefa exigente. Enfisematoso tecidos como encontraram em doenças como DPOC ou deficiência de alfa-1-antitripsina não pode suportar a pressão de enchimento de agarose e irá resultar em ruptura dos alvéolos e artefatos arquitetônicos. Nesses casos, o uso de agarose baixa concentração, por exemplo,, 1% (p/v), pode ser útil para diminuir a pressão e a velocidade durante o enchimento de agarose. No geral, o estado de doença do tecido drasticamente pode limitar o uso do tecido para a geração de combustível. Todos estes parâmetros determinam a quantidade de combustível que pode ser gerado a partir do tecido pulmonar, e também a quantidade de tempo necessário para produzir o combustível. Outras limitações de PCLS são inconsistências entre as fatias de pulmão diferente em relação ao conteúdo de tamanho ou tecido, o que requer mais etapas de normalização para experimentos. Para superar isso, socos de biópsia das regiões similares da mesma fatia podem ser gerados. Este procedimento é capaz de reduzir a variabilidade de tecido e, como benefício adicional, aumentar o número de amostras de combustível que pode ser usado para experiências.
Em conclusão, culturas de tecido humano pulmão 3D de agarose preenchido PCLS fornecer um complexo modelo humano para estudar a fisiologia do pulmão e doenças. O protocolo fornece uma descrição detalhada da preparação de PCLS de tecido pulmonar ressecado e seu cultivo e além disso aborda desafios em agarose enchimento de ressecções de pulmão humano e como superá-las.
The authors have nothing to disclose.
Os autores agradecem a Marisa Neumann para assistência técnica especializada. Todos os tecidos do pulmão foram gentilmente fornecidos pelo CPC-M Bio-arquivo. Este trabalho foi apoiado pelo centro alemão de bolsas de pesquisa do pulmão (DZL), a Helmholtz-gemeinschaft e CPC pesquisa escolar.
Vibratome Hyrax V50 | Zeiss | – | |
Hyrax CU 65 | Zeiss | – | |
Vasofix Braunüle 18G | B. Braun Melsungen AG | 4268130B | |
30mL NORM-INJECT | Henke Sass Wolf | 4830001000 | |
Guarded disposable scalpels, sterile | Swann-Morton | ||
Loctite 406 | Henkel | LOCTITE 406 | |
Synthetic Single Crystal Sapphire | Delaware Diamond Knives | – | |
Dulbecco's Modified Eagle Medium F-12 Nutreient Mixture (Ham) + L-Glutamine + 15mM HEPES | Gibco | 31330-038 | |
Penicillin Streptomycin | Gibco by Life Technologies | 15070-063 | |
Special process fetal bovine serum (Sera Plus) | Pan Biotech | P30-3702 | |
Disposable Biopsy Punch | pfm medical | 48401 | |
96 Well, Black/Clear, Tissue Culture Treated Plate, Flat Bottom with Lid, sterile | Falcon / Corning | 353219 | |
Agarose, low geling temperature | Sigma | A9414-100G |