Этот протокол описывает удаление и очистка легочной артерии эндотелиальных клеток (PAECs), которые придерживаться всплывающие подсказки Swan-Ganz катетеров, хотя они являются вклинивается в легочной артерии при катетеризации правых отделов сердца и остаются приверженцами дефлированный шар после удаления от тела пациента.
Различных патологий привести к легочной гипертензии (рН), который определяется как среднее легочной артерии давление превышает 25 мм рт ст, в состоянии покоя. Для дальнейшей диагностики и управления PH, пациенты проходят неоднократные правых отделов сердца catheterizations (РЦГ) которой Swan-Ganz катетер продвигается в филиал легочной артерии и воздушный шар надувается клин катетера. Эта статья показывает протокол которой эндотелиальные клетки легочной артерии (PAECs) могут быть найденным всплывающие подсказки Swan-Ganz катетеров после RHC и очищенный с методом столбец сходства анти CD146 для очистки предполагаемый PAECs. Эти клетки могут использоваться для обеспечения на местах снимок биологического состояния эндотелия легочных сосудистую дополнить гемодинамики измерений, полученных в ходе RHC. Собирают и очищенный PAECs может использоваться для любой культуры клеток или последующее аналитических анализов например потока cytometery.
Текущий США и европейские руководящие принципы требуют катетеризация правых отделов сердца для диагностики легочной гипертензии1. Врачи и ученые пытаются понять это заболевание желание биологических образцов от легких сосудистую дополнить гемодинамических данных, собранных во время RHC. К сожалению риск, связанный с легочной сосудистой биопсии очень высока, и поэтому биологических образцов легких сосудистую, редко, если когда-либо получить от жизни пациентов, перенесших RHC. Хотя много проницательность получил от сосудистой легочной ткани, полученные из трупной или описаны легких, эти примеры не могут отразить биологии процесс болезни рН, как она разворачивается в жизни пациента. В 2013 году мы впервые сообщили, что эндотелиальные клетки легочной артерии (PAECs) являются зачищенное от ветвей легочной артерии, физический контакт с всплывающую подсказку катетера Swan-Ganz во время RHC и могут быть восстановлены в небольших количествах от катетер советы После процедуры2.
Эта статья показывает нашу технику для удаления и очистки легочной артерии эндотелиальных клеток (PAECs) от всплывающие подсказки Swan-Ganz катетеров, после катетеризации правых отделов сердца. До сих пор методологии для выполнения этот метод урожая были описаны недостаточно подробно описаны в литературе для обеспечения единообразных результатов между лабораториями, выполнение метода. Эта статья предназначена для преодоления этого недостатка, предлагая визуализированных демонстрации техники, от постели сборник советов катетер для конечного продукта очищенный CD146 + эндотелиальных клеток. Этот метод должен помощь в продвижении исследований в pathobiology различных этиологий PH и привести к разработке новых диагностических анализов для дополнения гемодинамических данных, собранных в ходе RHC.
Важность этой техники к полю легочной сосудистой медицины и исследований, что он обеспечивает доступ к снимку биологии легочного эндотелия in situ и в отличие от предыдущих исследований на описаны или трупной легких, не представляют Конечная точка для субъекта легких. Недавно, мы показали, что анти apoptotic биомаркера в эти клетки могут иметь полезность в более точно фенотипирование связанных сортов легочная гипертензия3. Выход из клеток, полученных относительно мал, ~ 5, 000-25 000 PAECs на сэмпл и эти клетки являются сложным (но не невозможно) культуры. Мы считаем, что умные врачи и исследователи будут найти синергизма между этими методами компаньон выдвинуться легочной сосудистой исследования, диагностика и прогнозирование.
Метод, описанный в этой статье лучше всего ценится в контексте предыдущих экспериментальных парадигм для изучения легочного эндотелия. Предыдущие попытки получить PAECs от людей были ограничены описаны трупной легкие5 и недолго попытка разработать катетер, способных легочной артерии биопсии6. Как отмечается в недавно обзор7, настоящий техника отличается от легких тканей урожая по ее способности для получения PAECs от жизни человека и сделать это в нескольких точках время прогрессирования заболевания и/или терапии. Следует, однако, отметить, что метод компаньон недавно сообщалось whereby индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (IPSCs) может быть transdifferentiated в PAECs4,5. Этот метод производит обильные культур PAECs конкретного пациента и позволяет исследование воздействия конкретного пациента генетический фон на биологии паек. Несмотря на эти преимущества эти IPSC-производные PAECs не может предложить любую информацию о взаимодействии между местными микроокружения и генетический фон конкретного пациента. Наш собственный группа представила считает, что «Кэт наконечник» и методы IPSC, скорее всего будет синергетический в продвижении поле8.
В рамках этой настоящей и историческом контексте следует отметить ограничения этой техники. Во-первых важно отметить, что урожайность PAECs, производные от данного метода может существенно различаться. Предположительно пациент-, болезни государства – и врач специфические факторы способствуют этой изменчивости, как протокол не содержит шаги, которые будут, как ожидается, привести к крупным потерям исходного материала. Таблица 1 показывает представитель CD146 + дает от различных паек урожаи, используя советы катетер, полученные из целого ряда больных с различными заболеваниями государствами легочной гипертензии и ряд врач операторов. Во-вторых клеток дает общий низкий, и их жизнеспособности культуры оказался ниже, но в наших руках. В то время как ранее мы выросли культур PAECs, используя этот метод1, мы себя эти результаты представляют собой спасение подмножество прогениторных клеток после отмирания большинства образца и периодически успешна только в наших руках. Например это не редкость найти только несколько десятков сторонник PAECs в культуре на следующее утро после покрытием урожай. Часто эти микро культуры не доживает до расширения. Чтобы оптимизировать этот протокол в манере, которая будет поддерживать жизнеспособность PAECs и их условий в культуре для достижения желаемой цели распространения конкретного пациента паек урожаи необходима дальнейшая работа. Наконец положительный выбор CD146, которую мы адаптировали нельзя исключить загрязнение с другими CD146 + клеток, таких как циркулирующих эндотелиальные клетки4, pericytes, гладких мышечных клеток и редких CD146 + T клетки9,10. Тем не менее предполагается, что эти клетки являются очень малочисленны в пробах, собранных таким образом, и CD146 является значительно более конкретным, для этого протокола чем другие ячейки маркеры эндотелиальных клеток, таких как CD31 (которая также присутствует на различных кровь клетки, включая тромбоциты11). Любых будущих улучшений, направленных на улучшение специфики должны быть сбалансированы против их потенциально негативное влияние на урожайность.
The authors have nothing to disclose.
Авторы хотели бы поблагодарить врачей и вспомогательного персонала службы Advanced сердечной недостаточности и легочной гипертензии Аллеени Генеральной больницы для предоставления сотни образцов катетер в течение нескольких лет, которые способствовали оптимизации этой методологии.
100mm culture dish | Fisher | NC9385690 | |
15 mL Centrifuge Tubes | Midsci | C15R | |
16% Formaldehyde | Fisher | PI28908 | |
50 mL centrifuge tubes | Midsci | C50R | |
Accutase | Thermo | A1110501 | cell detachment solution |
Cell Scraper | Fisher | 08-100-241 | |
Endothelial Cell Growth media | Cell Applications | 211-500 | |
Forceps | any | ||
Hemostat | any | ||
LoBind microfuge tube | Fisher | 13-698-794 | |
Miltenyi CD146 beads | Miltenyi | 130-093-596 | |
Miltenyi FCR blocker | Miltenyi | 130-059-901 | |
Miltenyi LS columns | Miltenyi | 130-042-401 | |
Miltenyi magnet | Miltenyi | MidiMACS | |
Miltenyi RBC lysis buffer | Miltenyi | 130-094-183 | |
PBS | Fisher | BP2438-4 | |
Scissors | any | ||
Syringes | BD | 309597 |