פרוטוקול זה מתאר את ההסרה של טיהור של עורק הריאה אנדותל תאים (PAECs) לדבוק קצות בלון קטטר Swan-גנץ בעת שהם נמצאים תקוע בעורק הריאה במהלך צנתור הלב הימני יישארו חסיד בלון מנוכה בעקבות הסרת מן הגוף של המטופל.
מגוון רחב של פתולוגיות להוביל יתר לחץ דם ריאתי (PH), אשר מוגדר רשע עורק הריאה בלחץ העולה על 25 מ מ כספית במנוחה. עוד יותר לאבחן ולנהל PH, המטופלים עוברים הלב הימני חוזרות catheterizations (RHC) שבו קטטר Swan-גנץ מתקדמת לתוך ענף עורק הריאה, בלון מנופח לתקוע את קצה הקטטר. מאמר זה מדגים פרוטוקול לפיה תאי אנדותל עורק הריאה (PAECs) עשוי להיות שנקטפו לאחר RHC העצות בבועות טקסט של קטטר Swan-גנץ וטיהרו עם טכניקה טור אנטי-CD146 זיקה לטהר בשם PAECs. תאים אלה עשויה לשמש כדי לספק תמונה באתרו של מצב ביולוגי אנדותל להערכת ריאתי כהשלמה מדידות והמודינמיקה שהתקבל במהלך RHC. שנבצרו, מטוהרים PAECs עשוי לשמש גם תרבית תאים או עוקבות מבחני אנליטי כגון זרימת cytometery.
האמריקאי והאירופי לפי ההנחיות דורשות הלב הנכון צנתור לאבחון של יתר לחץ דם ריאתי1. רופאים, מדענים מחפשים להבין את המחלה רצון דגימות ביולוגיות להערכת ריאתי כדי להשלים את הנתונים והמודינמיקה הנאסף במהלך RHC. למרבה הצער, שהסיכון ביופסיה כלי דם ריאתי הוא גבוה מאוד, ולכן דגימות ביולוגיות של להערכת ריאתי הם לעיתים נדירות, אם אי פעם המתקבל החיים בחולים שעברו RHC. בעוד צברה הרבה תובנה של רקמת הריאה וסקולריים המתקבל cadaveric או הריאות explanted, הדוגמיות הללו אינם מסוגלים לשקף את הביולוגיה של תהליך המחלה PH כמו זה מתקיים לחולה לחיות. בשנת 2013, אנחנו קודם דיווחו תאי אנדותל עורק הריאה (PAECs) הם חשופה מן הענפים של עורק הריאה על ידי מגע פיזי עם בלון קצה הצנתר ברבור-גנץ במהלך RHC, ניתן לשחזר במספרים קטנים מן העצות קטטר לאחר הליך2.
מאמר זה מדגים את הטכניקה שלנו עבור הסרת וטיהור תאי אנדותל עורק הריאה (PAECs) מכל קצות בלון קטטר Swan-גנץ בעקבות הלב הנכון צנתור. עד כה, המתודולוגיה לביצוע טכניקה זו הקציר תואר בפירוט לא מספיק בספרות כדי להבטיח תוצאות אחיד בין מעבדות ביצוע הטכניקה. מאמר זה נועד להתגבר על מחסור, המציע מטמיעים הפגנה של הטכניקה, מאוסף המיטה קטטר הטיפים כדי המוצר הסופי של מטוהרים CD146 + אנדותל תאים. טכניקה זו צריכה לסייע בקידום המחקר לתוך pathobiology חבלות מסיבות שונות של PH, יכול לגרום בפיתוח של מבחני אבחון חדש כדי להשלים והמודינמיקה הנתונים שנאספו במהלך RHC.
החשיבות של טכניקה זו בתחום המחקר והרפואה כלי דם ריאתי הוא כי זה מספק גישה תצלום בזק של הביולוגיה של אנדותל ריאתי באתרו, בניגוד מחקרים מוקדמים יותר על הריאות explanted או cadaveric, לא מייצג נקודת קצה של הנושא ריאות. לאחרונה, הראינו כי סמן אנטי-מוות תאים אלה עשויה להיות תועלת ב ליתר דיוק phenotyping הקשורים זנים של יתר לחץ דם ריאתי3. התשואה של תאים שהושג הוא יחסית קטן, ~ 5, 000-25,000 PAECs עבור דגימה, תאים אלה הם קשים (אך לא בלתי אפשרי) לתרבות. אנו מאמינים כי חכם קלינאים וחוקרים ימצא הסינרגיה בין שיטות אלה מסייע על מנת לקדם מחקר כלי דם ריאתי, אבחון, prognostics.
בטכניקה המתוארת במאמר זה ניתנת להערכה הטובה ביותר בהקשר של פרדיגמות ניסיוני הקודם לימוד של אנדותל כלי הדם בריאות. ניסיונות קודמים להשיג PAECs של בני האדם היה מוגבל בריאות explanted/cadaveric5 ועל ניסיון קצר כדי לפתח צנתר מסוגל עורק הריאה ביופסיה6. כאמור ב- סקירה האחרונות7, הטכניקה נוכח נבדל הקציר רקמת הריאה על ידי יכולתו להשיג PAECs של אדם חי, עושים זאת על מספר נקודות זמן ההתקדמות המחלה ו/או טיפול. עם זאת, יצוין כי טכניקה לוויה לאחרונה דווחה לפיה המושרה בתאי גזע pluripotent (IPSCs) יכול להיות transdifferentiated לתוך4,PAECs5. טכניקה זו מייצרת תרבויות בשפע של המטופל הספציפי PAECs ומאפשרת חקר השפעת רקע גנטי לחולה ספציפי על ביולוגיה PAEC. למרות היתרונות האלה, אלה PAECs נגזר IPSC יכול להציע מידע לגבי האינטראקציה בין microenvironment המקומי לבין הרקע הגנטי של החולה הספציפי. קבוצה משלנו הציגה את התצוגה כי “הצנתור עצה” וטכניקות IPSC צפויים להיות סינרגיסטי בקידום שדה8.
במסגרת זו מתנת והיסטוריים, המגבלות של טכניקה זו יש לציין. ראשית, חשוב לציין כי התשואות של PAECs נגזר בשיטה זו יכול להשתנות במידה ניכרת. ככל הנראה, החולה-, מחלת ספציפיים למדינה או רופא גורמים תורמים ההשתנות, כמו הפרוטוקול אינו מכיל שלבים הייתה צפויה לגרום אובדן גדול של חומר המקור. טבלה 1 מציגה את נציג ש-cd146 + התשואות בין מגוון רחב של יבול PAEC ניצול טיפים קטטר המתקבל מגוון רחב של חולים עם מצבי מחלה שונים של יתר לחץ דם ריאתי במגוון אופרטורים רופא. שנית, התשואות תא הכוללת נמוכה הינם הנביטה שלהם לתרבות הוכיחה להיות נמוך עדיין בידיים שלנו. בזמן שלמדנו בעבר תרבויות PAECs באמצעות שיטה זו1, אנו מניחים הצלה מייצגים אלה תוצאות של קבוצת משנה של ובתאים בעקבות die-off של רוב המדגם, הוא רק לסירוגין מוצלח בידיים שלנו. לדוגמה, זה לא נדיר למצוא רק כמה עשרות מחסידי PAECs בתרבות בבוקר לאחר הקציר היה מצופה. לעיתים קרובות המיקרו-תרבויות אלה אינם שורדים להתרחבות. עבודה נוספת יש צורך לייעל את פרוטוקול זה באופן תחזק את הכדאיות של PAECs והתנאים שלהם בתרבות כדי להשיג את המטרה הרצויה של התפשטות של המטופל הספציפי PAEC יבול. בסופו של דבר, הבחירה חיובי CD146 שאנחנו הסתגלו יכול שלא לכלול זיהום עם CD146 + תאים אחרים, כגון העברת תאי אנדותל4, pericytes, תאי שריר חלק, נדיר CD146 + T תאים9,10. יחד עם זאת, תאים אלה הם בחזקת להיות מעט מאוד במספר הדגימות שנאספו באופן זה, CD146 היא במידה ניכרת ספציפית עבור פרוטוקול זה יותר סמנים אחרים התא של תאי אנדותל כגון CD31 (אשר נמצאת גם על מגוון נישא בדם תאים כולל טסיות11). שיפורים עתידיים כלשהם שמטרתם לשפר את ירידה לפרטים לאזן נגד שלהם השפעה שלילית פוטנציאלית על התשואה.
The authors have nothing to disclose.
המחברים רוצה תודה לרופאים את הצוות של שירות אי ספיקת לב מתקדמת יתר לחץ דם ריאתי של בית החולים הכללי אלגני ותמיכה במתן מאות דוגמאות קטטר על פני מספר שנים יש פוריה אופטימיזציה של מתודולוגיה זו.
100mm culture dish | Fisher | NC9385690 | |
15 mL Centrifuge Tubes | Midsci | C15R | |
16% Formaldehyde | Fisher | PI28908 | |
50 mL centrifuge tubes | Midsci | C50R | |
Accutase | Thermo | A1110501 | cell detachment solution |
Cell Scraper | Fisher | 08-100-241 | |
Endothelial Cell Growth media | Cell Applications | 211-500 | |
Forceps | any | ||
Hemostat | any | ||
LoBind microfuge tube | Fisher | 13-698-794 | |
Miltenyi CD146 beads | Miltenyi | 130-093-596 | |
Miltenyi FCR blocker | Miltenyi | 130-059-901 | |
Miltenyi LS columns | Miltenyi | 130-042-401 | |
Miltenyi magnet | Miltenyi | MidiMACS | |
Miltenyi RBC lysis buffer | Miltenyi | 130-094-183 | |
PBS | Fisher | BP2438-4 | |
Scissors | any | ||
Syringes | BD | 309597 |