Este protocolo descreve a remoção e purificação de células endoteliais artéria pulmonar (PAECs) que aderem as dicas de balão de cateteres de Swan-Ganz, enquanto eles estão encravados na artéria pulmonar durante o cateterismo cardíaco direito e permanecer aderente para o balão vazio após a remoção do corpo do paciente.
Uma variedade de patologias levam a hipertensão pulmonar (PH), que é definido como uma pressão média de artéria pulmonar superior a 25 mmHg em repouso. Para além disso, diagnosticar e gerenciar PH, pacientes submetidos a cateterismos coração certo repetidas (RHC) no qual um cateter de Swan-Ganz é avançado a um ramo da artéria pulmonar e um balão é inflado para Cunha a ponta do cateter. Este artigo ilustra um protocolo pelo qual células endoteliais de artéria pulmonar (PAECs) podem ser colhidas as dicas de balão de cateteres de Swan-Ganz depois RHC e purificadas com uma técnica de coluna de afinidade de anti-CD146 para purificar PAECs putativos. Estas células podem ser usadas para fornecer um instantâneo no local do estado biológico do endotélio vasculatura pulmonar para complementar medidas hemodinâmicas, obtidas durante RHC. Colhidos e PAECs purificados podem ser utilizados para qualquer cultura de pilha ou para ensaios analíticos posteriores tais como cytometery de fluxo.
As diretrizes atuais de americanos e europeus exigem cateterismo do coração direito para o diagnóstico de hipertensão pulmonar1. Médicos e cientistas, buscando entender esta doença desejam amostras biológicas da vasculatura pulmonar para complementar os dados hemodinâmicos que são reunidos durante o RHC. Infelizmente, o risco associado à biópsia vascular pulmonar é muito alto, e, portanto, amostras biológicas da vasculatura pulmonar são raramente se já obtidos de pacientes vivos submetidos a RHC. Enquanto muito discernimento tem sido adquirido com o tecido vascular pulmonar obtidos de fetos mortos ou explantados pulmões, estas amostras são incapazes de refletir na biologia do processo de doença de PH como isso se desenrola em um paciente vivo. Em 2013, nós primeiro relatou que células endoteliais de artéria pulmonar (PAECs) são desmatadas dos ramos da artéria pulmonar por contato físico com a ponta do balão do cateter de Swan-Ganz durante RHC e podem ser recuperadas em pequenos números das pontas de cateter após o procedimento2.
Este artigo ilustra nossa técnica para a remoção e purificação de células endoteliais de artéria pulmonar (PAECs) das dicas de balão de cateteres de Swan-Ganz após cateterismo cardíaco direito. Até então, a metodologia para a realização desta técnica de colheita tem sido descrita em detalhes insuficientes na literatura para garantir resultados uniformes entre laboratórios, realizando a técnica. Este artigo destina-se a superar essa deficiência, oferecendo visualizada demonstração da técnica, de cabeceira coleção de pontas de cateter até o produto final das células endoteliais purificadas CD146 +. Esta técnica deve ajudar em fazer avançar a pesquisa para o Patobiológico de várias etiologias de PH e possivelmente resultar no desenvolvimento de novos ensaios de diagnósticos para complementar os dados hemodinâmicos coletados durante RHC.
A importância desta técnica para o campo de pesquisa e medicina vascular pulmonar é que fornece acesso a um snapshot da biologia do endotélio pulmonar in situ e em contraste com os estudos anteriores sobre pulmões explantados ou cadavéricos, não representa um ponto de extremidade para o pulmão do sujeito. Recentemente, mostramos que um biomarcador de antiapoptose nestas células pode ter utilidade na fenotipagem mais precisamente relacionado a variedades de hipertensão pulmonar3. O rendimento das células obtidas é relativamente pequeno, ~ 5, 000-25.000 PAECs por amostra e essas células são difícil (mas não impossível) para cultura. Acreditamos que os pesquisadores e clínicos inteligentes irão encontrar sinergias entre estas técnicas de companheiro para avançar prognósticos, diagnóstico e investigação vascular pulmonar.
A técnica descrita neste artigo é melhor apreciada no âmbito da anteriores paradigmas experimentais para o estudo do endotélio vascular pulmonar. Tentativas anteriores para obter PAECs de seres humanos foram limitadas ao pulmões explantados/cadavéricos5 e uma vida curta tentativa de desenvolver um cateter capaz de artéria pulmonar biópsia6. Como observado em uma recente revisão7, a técnica presente é distinto de colheita do tecido pulmonar pela sua capacidade para obter PAECs de uma vida humana e a fazê-lo em vários pontos de tempo na progressão da doença e/ou terapia. No entanto, deve notar-se que uma técnica de companheiro recentemente relatou pelo qual induzidas (IPSCs) as células-tronco pluripotentes podem ser transdifferentiated em PAECs4,5. Esta técnica produz abundantes culturas de PAECs paciente específico e permite o estudo dos efeitos da base genética do paciente específico sobre a biologia do PAEC. Apesar dessas vantagens, estes PAECs de IPSC-derivado não podem oferecer qualquer informação sobre a interação entre o microambiente local e a base genética do paciente específico. Nosso grupo apresentou a visão de que a “ponta de cath” e técnicas IPSC são prováveis ser sinérgica no avanço do campo8.
Dentro deste contexto actual e histórico, devem notar-se as limitações desta técnica. Em primeiro lugar, é importante observar que os rendimentos de PAECs derivados desse método podem variar consideravelmente. Presumivelmente, paciente-, doença estado médico-específicas e fatores contribuem para esta variabilidade, como o protocolo não contém etapas que seria esperadas para resultar em perdas de matéria-prima. A tabela 1 mostra representante que cd146 + rendimentos de uma variedade de colheitas PAEC utilizando pontas de cateter obtidas de uma variedade de pacientes com Estados de doença diferente da hipertensão pulmonar e uma variedade de operadores de médico. Em segundo lugar, rendimentos de célula são baixa global, e sua viabilidade para cultura tem provado para ser mais baixo ainda em nossas mãos. Enquanto nós crescemos anteriormente culturas de PAECs usando este método1, podemos supor que esses resultados representam resgate de um subconjunto de células progenitoras seguindo die-off da maioria da amostra e apenas intermitentemente sucesso em nossas mãos. Por exemplo, não é incomum encontrar apenas algumas dezenas de aderente PAECs na cultura da manhã depois de uma colheita tem sido chapeada. Muitas vezes estes microculturas não sobrevivem à expansão. É necessário mais trabalho para otimizar este protocolo de forma que sustentará a viabilidade de PAECs e suas condições de cultura para atingir o objetivo desejado de propagação de colheitas PAEC paciente específico. Finalmente, a seleção positiva CD146 adaptámos não pode excluir a contaminação com outras CD146 + células, como células endoteliais4, pericitos, células musculares lisas e raros CD146 + T células9,10de circulação. No entanto, estas células são presume-se que muito poucos em número, em amostras recolhidas desta forma e CD146 é consideravelmente mais específico para este protocolo que outros marcadores de células de células endoteliais, como CD31 (que também está presente em uma variedade de transmitidas pelo sangue células, incluindo as plaquetas,11). Quaisquer melhorias futuras destinadas a melhorar a especificidade devem ser equilibradas contra seus efeitos potencialmente negativos sobre o rendimento.
The authors have nothing to disclose.
Os autores gostaria de agradecer aos médicos e pessoal de serviço avançado cardíaca e hipertensão pulmonar de Allegheny General Hospital de apoio para a prestação de centenas de amostras de cateter durante vários anos que facilitaram a otimização desta metodologia.
100mm culture dish | Fisher | NC9385690 | |
15 mL Centrifuge Tubes | Midsci | C15R | |
16% Formaldehyde | Fisher | PI28908 | |
50 mL centrifuge tubes | Midsci | C50R | |
Accutase | Thermo | A1110501 | cell detachment solution |
Cell Scraper | Fisher | 08-100-241 | |
Endothelial Cell Growth media | Cell Applications | 211-500 | |
Forceps | any | ||
Hemostat | any | ||
LoBind microfuge tube | Fisher | 13-698-794 | |
Miltenyi CD146 beads | Miltenyi | 130-093-596 | |
Miltenyi FCR blocker | Miltenyi | 130-059-901 | |
Miltenyi LS columns | Miltenyi | 130-042-401 | |
Miltenyi magnet | Miltenyi | MidiMACS | |
Miltenyi RBC lysis buffer | Miltenyi | 130-094-183 | |
PBS | Fisher | BP2438-4 | |
Scissors | any | ||
Syringes | BD | 309597 |