该方案描述了肺动脉内皮细胞 (paec) 的切除和纯化, 这些细胞在右心导管插入过程中卡在肺动脉中并粘附在肺动脉中, 粘附在天鹅-甘茨导管的球囊尖端上。从病人体内取出后的放气气球。
多种疾病会导致肺动脉高压 (ph), 其定义是静止时肺动脉压超过25毫米汞柱。为了进一步诊断和管理 ph, 患者接受反复右心导管插入术 (rhc), 其中 swan-ganz 导管进入肺动脉的一个分支, 并充气球囊以楔形导管尖端。本文说明了一种方案, 根据该方案, 可以从 swan-ganz 导管的球囊尖端中提取, 并采用抗 cd146 亲和柱技术进行纯化, 以净化假定的 paec。这些细胞可用于提供肺血管内皮细胞的生物状态的现场快照, 以补充在 rhc 期间获得的血流动力学测量。收获和纯化的 paec 可用于细胞培养或后续分析分析, 如流细胞分裂。
目前的美国和欧洲指南要求右心导管插入术诊断肺动脉高压 1。医生和科学家试图了解这种疾病需要生物样本从肺血管, 以补充在 rhc 期间收集的血流动力学数据。不幸的是, 与肺血管活检相关的风险非常高, 因此, 很少从接受 rhc 的活患者那里获得肺血管的生物样本。虽然从从尸体或被转移的肺获得的肺血管组织获得了很多洞察, 但这些样本无法反映 ph 疾病过程在活体患者中展开时的生物学。2013年, 我们首次报告, 肺动脉内皮细胞 (paec) 在 rhc 期间, 通过与 swan-gonz 导管的球囊尖端发生物理接触, 从肺动脉的分支中被剥夺, 并且可以从导管尖端中少量恢复在做法2以后。
本文阐述了我们的技术, 去除和纯化肺动脉内皮细胞 (paec) 从球囊提示的天鹅甘兹导管后右心导管。迄今为止, 在文献中对执行这种收获技术的方法描述得不够详细, 以确保执行该技术的实验室之间的统一结果。本文旨在克服这一缺陷, 提供该技术的可视化演示, 从床头收集导管提示到纯化 cd146 + 内皮细胞的最终产品。这项技术应有助于推进各种 ph 病因的病理生物学研究, 并可能导致新的诊断检测的发展, 以补充在 rhc 期间收集的血流动力学数据。
这项技术对肺血管医学和研究领域的重要性在于, 它提供了一个现场肺内皮的生物学快照, 与早期关于肺的解释或尸体肺的研究不同, 并不代表受试者肺的终点。最近, 我们已经证明, 在这些细胞的抗凋亡生物标志物可能有有用的更准确地表型相关品种的肺动脉高压3。所获得的细胞产量相对较小, 每个样本约为 5000-25000 paec, 这些细胞难以 (但并非不可能) 培养。我们相信, 聪明的临床医生和研究人员将发现这些配套技术之间的协同作用, 以推进肺血管研究, 诊断和预后。
本文中描述的技术是最好的赞赏, 在以前的实验范式的研究肺血管内皮。以前从人类那里获得 paec 的尝试仅限于解释地道: 心肺5和开发能够进行肺动脉活检的导管的短暂尝试。正如最近的一篇评论7所指出的, 目前的技术与肺组织收获的区别在于它能够从活人那里获得 paecs, 并在疾病进展和治疗的多个时间点获得 paec。然而, 应当指出的是, 最近有报道称, 一种配套技术可以将诱导多能干细胞 (ipsc) 分化为 paec4,5。这项技术产生了丰富的培养患者特异性 paec, 并允许研究患者特定遗传背景对 paec 生物学的影响。尽管有这些优势, 但这些 ipsc 衍生的 paec 不能提供任何关于局部微环境与患者特定遗传背景之间相互作用的信息。我们自己的团队提出的观点是, “导管提示” 和 ipsc 技术可能会协同推进该领域8。
在目前和历史的背景下, 应注意到这一技术的局限性。首先, 需要注意的是, 从这种方法中得出的 paec 的产量可能差别很大。据推测, 针对患者、疾病状况和医生的因素促成了这种变异性, 因为该议定书不包含预计会导致源材料重大损失的步骤。表 1显示了来自 paec 各种收获的代表性 cd146 + 产量, 这些作物使用的导管提示来自不同疾病状态的肺动脉高压患者和各种医生操作人员。其次, 细胞产量总体较低, 其培养的生存能力已被证明较低, 但在我们手中。虽然我们以前使用这种方法1培养过 paec, 但我们假设这些结果代表了大多数样本死亡后对祖细胞子集的抢救, 并且在我们手中只是间歇性地成功。例如, 在收获被镀金后的第二天早上, 在文化中只发现几十只有几十只有依恋的 paec 并不鲜见。这些微文化往往无法生存到扩张。需要进一步开展工作, 优化该议定书, 以维持太平洋建筑设施的可行性及其在文化中的条件, 从而实现传播针对病人的 paec 收成的预期目标。最后, 我们所适应的 cd146 阳性选择不能排除与其他 cd146+ 细胞的污染, 如循环内皮细胞4、周细胞、平滑肌细胞和罕见的 cd146+ t 细胞9,10。然而, 在以这种方式采集的样本中, 这些细胞被认为数量很少, cd146 在这一方案中的特异性远远高于 cd31 等内皮细胞的其他细胞标记物 (cd31 (也存在于各种血液传播的细胞) 上细胞, 包括血小板11)。今后任何旨在提高特异性的改进都应与它们对产量的潜在负面影响相平衡。
The authors have nothing to disclose.
作者要感谢阿莱根尼总医院高级心力衰竭和肺动脉高压服务机构的医生和支持人员, 感谢他们在几年内提供了数百种导管样本, 为这种方法的优化。
100mm culture dish | Fisher | NC9385690 | |
15 mL Centrifuge Tubes | Midsci | C15R | |
16% Formaldehyde | Fisher | PI28908 | |
50 mL centrifuge tubes | Midsci | C50R | |
Accutase | Thermo | A1110501 | cell detachment solution |
Cell Scraper | Fisher | 08-100-241 | |
Endothelial Cell Growth media | Cell Applications | 211-500 | |
Forceps | any | ||
Hemostat | any | ||
LoBind microfuge tube | Fisher | 13-698-794 | |
Miltenyi CD146 beads | Miltenyi | 130-093-596 | |
Miltenyi FCR blocker | Miltenyi | 130-059-901 | |
Miltenyi LS columns | Miltenyi | 130-042-401 | |
Miltenyi magnet | Miltenyi | MidiMACS | |
Miltenyi RBC lysis buffer | Miltenyi | 130-094-183 | |
PBS | Fisher | BP2438-4 | |
Scissors | any | ||
Syringes | BD | 309597 |