يستخدم خط الخلايا السرطانية الجنينية P19 (خط الخلية P19) على نطاق واسع لدراسة الآلية الجزيئية للتكوين العصبي مع تبسيط كبير بالمقارنة مع تحليل في الجسم الحي. هنا، نقدم بروتوكول ًا للتكوين العصبي الناجم عن حمض الريتينويك في خط الخلية P19.
خط الخلية P19 المستمدة من سرطان التراتوسرطان الفأر المستمدة من الأجنة لديه القدرة على التمييز في الطبقات الجرثومية الثلاث. في وجود حمض الريتينويك (RA)، يتم حث خط الخلية P19 المعلق المستزرع للتمييز في الخلايا العصبية. يتم التحقيق في هذه الظاهرة على نطاق واسع كنموذج تكوين الأعصاب في المختبر. ولذلك، فإن خط الخلية P19 مفيد جدا للدراسات الجزيئية والخلوية المرتبطة تكوين الأعصاب. ومع ذلك، بروتوكولات للتمايز العصبية من خط الخلية P19 الموصوفة في الأدب معقدة جداً. الطريقة التي وضعت في هذه الدراسة بسيطة وسوف تلعب دورا في توضيح الآليات الجزيئية في تشوهات النمو العصبي والأمراض العصبية التنكسية.
أثناء النمو الجنيني، يتم تحويل طبقة خليةواحدة إلى ثلاث طبقات جرثومية منفصلة 1،2،3. ولزيادة إمكانيات البحث عن الظواهر التي تحدث في الجسم الحي، تم تطوير توليد المجاميع ثلاثية الأبعاد (الأجسام الجنينية) كنموذج ملائم. المجاميع الخلوية التي تتشكل بهذه الطريقة يمكن أن تتعرض لظروف مختلفة تسبب تمايز الخلايا، والتي تعكس تطور الجنين4،5. يستخدم خط الخلايا السرطانية الجنينية P19 murine (خط الخلية P19) عادة كنموذج خلوي لدراسات تكوين الأعصاب في المختبر6و7و8. يعرض خط الخلية P19 ميزات الخلايا الجذعية متعددة القوى النموذجية ويمكن أن تميز في الخلايا العصبية في وجود حمض الريتينويك (RA) أثناء تجميع الخلايا تليها نمو النيورايت في ظل ظروف الالتزام. وعلاوة على ذلك، فإن خط الخلية P19 غير المتمايزة قادر أيضا على تشكيل خلايا تشبه العضلات وعضلة القلب تحت تأثير كبريتيد ثنائي الميثيل (DMSO)9،10،11،12.
وقد تم الإبلاغ عن العديد من الطرق13،14،15،16 للتمايز العصبية ، ولكن المنهجية معقدة في بعض الأحيان وليس من السهل فهمها من خلال قراءة الأوصاف فقط. على سبيل المثال، تتطلب البروتوكولات في بعض الأحيان مزيجًا من وسط النسر المعدل (DMEM) من Dulbecco (DMEM) المكمّل بمزيج من مصل العجل (CS) ومصل البقر الجنيني (FBS)13. وعلاوة على ذلك، غالبا ما تتكون وسائل الإعلام المستخدمة لتطوير الخلايا العصبية من المكملات العصبية وB2713،14،15،16. وعلى هذا النحو، فإن الأساليب القائمة تنطوي على تعقيد في إعدادها، وهدفنا هنا هو تبسيط البروتوكولات. في هذه الدراسة، أظهرنا أن DMEM مع FBS يمكن استخدامها للحفاظ على خط الخلية P19 (DMEM + 10٪ FBS) وكذلك لتطوير الخلايا العصبية (DMEM + 5٪ FBS + RA). هذه الطريقة المبسطة للتكوين العصبي باستخدام خط الخلية P19 يسمح لنا لدراسة الآلية الجزيئية لكيفية تطوير الخلايا العصبية. وعلاوة على ذلك، يتم إجراء البحوث على الأمراض العصبية مثل مرض الزهايمر أيضا باستخدام خط الخلية P1917،18، ونعتقد أن الطريقة التي وضعت في هذه الدراسة سوف تلعب دورا في توضيح الآليات الجزيئية في تشوهات النمو العصبي والأمراض العصبية.
هنا، ونحن نصف بروتوكول بسيط لتكوين الأعصاب باستخدام خط الخلية P19. على الرغم من أن العديد من التقارير قد نشرت في هذا الصدد، لا تزال منهجية مفصلة للتحريض تكوين الأعصاب باستخدام خط الخلية P19 غير واضحة. وعلاوة على ذلك، استخدمنا الجلوكوز عالية بسيطة (4500 ملغ / لتر) DMEM المتوسطة مع 10٪ FBS للتجربة بأكم?…
The authors have nothing to disclose.
وحظيت الدراسة بدعم مالي من المركز الوطني للعلوم في بولندا (منحة رقم. UMO-2017/25/N/NZ3/01886) وKNOW (مركز البحوث الوطنية الرائدة) الاتحاد العلمي “صحة الحيوان – الغذاء الآمن”، قرار وزارة العلوم والتعليم العالي رقم 05-1/KNOW2/2015
6x DNA Loading Dye | EURx | E0260-01 | |
Agarose | Sigma- Aldrich | A9539 | |
cDNA synthesis kit | EURx | E0801-02 | |
DAPI (4′,6-Diamidine-2′-phenylindole dihydrochloride) | Sigma- Aldrich | 10236276001 | Working concentration: 1 μg/mL |
DMEM high glucose (4.5 g/L) with L-glutamine | Lonza | BE12-604Q | |
Ethanol 99.8% | Chempur | CHEM*613964202 | |
Fetal Bovine Serum (FBS) | EURx | E5050-03 | |
MAP2 antibody | Thermo Fisher Scientific | PA517646 | Dilution 1:100 |
PCR reaction kit | EURx | E0411-03 | |
Penicillin/Streptomycin 10K/10K | Lonza | DE17-602E | |
Phosphate Buffered Saline (PBS), 1x concentrated without Ca2+, Mg2+ | Lonza | BE17- 517Q | |
Retinoic acid | Sigma- Aldrich | R2625-50MG | dissolved in 99.8% ethanol; store in -20 °C up to 6 months |
Secondary Antibody (Alexa Fluor 488) | Thermo Fisher Scientific | A11034 | Dilution 1:500 |
Skim milk | Sigma- Aldrich | 1153630500 | |
TBE Buffer | Thermo Fisher Scientific | B52 | |
Triton-X 100 | Sigma- Aldrich | T8787-100ML | |
Trypsin 0.25% – EDTA in HBSS, without Ca2+, Mg2+,with Phenol Red | biosera | LM-T1720/500 | |
Cell Culture Plastics | |||
1 mL Serological Pipettes | Profilab | 515.01 | |
10 mL Serological Pipettes | Profilab | 515.10 | |
100 mm dish dedicated for suspension culture | Corning | C351029 | |
15 mL centrifuge tubes | Sigma- Aldrich | CLS430791-500EA | |
5 mL Serological Pipettes | Profilab | 515.05 | |
6-well plate | Corning | CLS3516 | |
Cell culture flasks, surface area 25 cm2 | Sigma- Aldrich | CLS430639-200EA |