Чтобы проверить тормозящее действие фармакологических агентов на фосфолипаза C (PLC) в различных регионах мозга пчелы, мы представляем биохимического анализа для измерения активности PLC в этих регионах. Этот assay может быть полезным для сравнения PLC активность тканей, а также среди пчел, экспонирование различных поведений.
Пчелы-организм модель для оценки сложного поведения и выше функции мозга, таких как обучение, память и разделение труда. Грибные тела (МБ) — выше мозга центр предложил быть нейронных субстрат поведения сложных пчелы. Хотя предыдущие исследования генов и белков, которые выражаются дифференцировано в MBs и других регионах мозга, деятельность белков в каждом регионе еще не понял полностью. Раскрыть функции этих белков в головном мозге, фармакологический анализ целесообразный подход, но сначала необходимо подтвердить, что Фармакологическое манипуляции действительно изменить активность белка в этих регионах мозга.
Мы ранее выявленные выше выражение генов, кодирующих фосфолипаза C (PLC) в MBs чем в других регионах мозга и фармакологически оценку участия PLC в поведении медоносных пчел. В этом исследовании мы биохимически проверили два фармакологических агентов и подтвердили, что они снижение активности PLC в MBs и других регионах мозга. Здесь мы представляем подробное описание о том, как обнаружить PLC деятельность в пчелы мозга огневки. В этой системе пробирного гомогенатах, полученных от различных мозга прореагировало с синтетическими fluorogenic субстрат, и флуоресценции, результатом деятельности PLC количественно и сравнении между областями мозга. Мы также обсудим наши оценки тормозящее действие некоторых лекарств на активность PLC, используя ту же систему. Хотя эта система, вероятно, пострадавших от других эндогенных флуоресценции соединений и/или абсорбция пробирного компонентов и тканей, измерения деятельности PLC, с помощью этой системы безопаснее и проще, чем, с помощью традиционных assay, который требует radiolabeled субстратов. Простые процедуры и манипуляции позволяют нам проанализировать деятельность PLC в мозги и других тканях медоносных пчел, участвующих в различных социальных задач.
Европейская медоносной пчелы (Apis mellifera L.) является эусоциальных насекомых, и Женский пчел Показать каста зависимых воспроизводства и зависящих от возраста разделение труда. Например в стерильных касты пчел, упоминаемые как «рабочие», молодых людей кормить выводка, в то время как старые комбикорма нектара и пыльцы вне куст1. Обучение и память, что способность критически важную роль в жизни пчелы, потому что кормоуборочные комбайны должны постоянно идти вперед и назад между источниками продовольствия и их гнезда и затем общаться расположения источников хорошее питание для их nestmates через танец сообщение1. Предыдущие исследования показали, что MB, выше мозговой центр в насекомых, участвует в учить и память способности пчелы2,3,4. Дифференциально выраженной генов и белков были определены в различных регионах мозга пчелы5,6,,78,9,10 ,11, предполагая, что они связаны с уникальными функциями каждой области мозга. Хотя фармакологических ингибирования или активации белка интерес представляет собой хорошо использовать подход к раскрыть функцию белка в пчелы поведение12,13,14, это неизвестно ли все наркотики иметь функциональные последствия в различных регионах мозга медоносной пчелы. Проверка функций таких наркотиков будет укреплять выводы исследования поведенческой фармакологии.
Здесь мы сосредоточены на PLC, один из ферментов, причастных к мыши познания15,16,17,18. PLC кальция триггеры сигнализации от унижающего достоинство фосфатидилинозитол 4,5-Бисфосфат (пункт2) в инозитол 1,4,5-trisphosphate (IP-3) и диацилглицерол (ГПДР)19,,2021. IP3 открывает IP3 рецепторов в эндоплазматический ретикулум (ER), приводит к высвобождению ионов кальция от ER. Выпущенные кальция активирует кальция/Кальмодулин зависимая протеинкиназа II (CaMKII) с Кальмодулин и протеинкиназы C (PKC) в присутствии группы доступности базы данных. Обе протеинкиназы участвуют в процессе обучения и памяти22,23, в соответствии с привлечением PLC в этот процесс. ПЛК делятся на подтипы, включая PLCβ, PLCγ и PLCε, на основе их структуры20. Каждый подтип PLC активируется в другом контексте20, и генов, кодирующих эти подтипы дифференциально выражаются в различных тканях. Ранее мы показали, что пчелы MBs выражать гены, кодирующие PLCβ и PLCε подтипы на более высоких уровнях, чем остальные регионы мозга24, и что две пан PLC ингибиторы (edelfosine и неомицина сульфат [неомицин]) снижение активности PLC в различных регионах мозга и, действительно, влияют на обучение и память способность пчел24.
Традиционно Ферментативная активность PLC была измерена с помощью radiolabeled PIP225, который требует надлежащей подготовки, оборудования и средств. Недавно синтетических fluorogenic субстрат PLC был установленным26, что делает его легко оценить деятельность PLC в стандартных лаборатории. Здесь мы представляем подробный протокол для обнаружения деятельности PLC в различных мозга пчелы с использованием fluorogenic субстрата и впоследствии проверить тормозящее действие edelfosine и неомицина на PLC в этих тканях. Потому что протокол требует только основные манипуляции, могут быть применимы к исследования PLC активность в других тканях или областей мозга в пчел, выделенных для различных социальных задач.
Биохимические экспертиза деятельности белка крайне важно для понимания молекулярных сигналов в головном мозге, потому что активность фермента зависит от различных молекул, например субстратов и ингибиторов и может таким образом, изменить вместе с поведение животных (например, о?…
The authors have nothing to disclose.
Рисунок 4B – 4 D был изменен с Suenami и др. 24 с разрешения открытого биологии. Авторы выражают благодарность к издателю для разрешения. Эта работа была поддержана человека пограничной науки программы (RGY0077/2016) Шота Suenami и Ryo Миядзаки.
Pierce BCA Protein Assay Kit | ThermoFisher Scientific | 23227 | The reagent kit for measurement of protein concentration |
Pierce Bovine Serum Albumin Standard Ampules 2mg/mL | ThermoFisher Scientific | 23209 | The standard samples used in BCA assay |
Paraffin wax | GC | 13B1X00155000141 | Dental wax used as dissection stage |
Insect pin | Shiga | No. 0 | Stainless, solid head |
PLCglow | KXT Bio | KCH-0001 | A fluorogenic substrate of PLC |
384-well microplate | Corning | 4511 | Low-volume, round-bottom plate in black color |
Gemini EM microplate reader | Molecular Devices | ||
Edelfosine | Santa Cruz Biotechnology | sc-201021 | pan-PLC inhibitor |
Neomycin sulfate | Santa Cruz Biotechnology | sc-3573 | pan-PLC inhibitor |