Özet

高スループット、高コンテンツ、液体ベースのc. の elegans病態システム

Published: July 01, 2018
doi:

Özet

ここでは適応可能、全体のホスト、ホスト病原体の相互作用を研究し、創薬に使用することが出来、高コンテンツ スクリーニング ツール プロトコルについて述べる。

Abstract

識別される新薬の数によって、伝統的な体外画面は暮れゆき、多剤耐性を戦闘に新たな武器を求めてこのアプローチの成功を減らすこと。これは、研究者はのみ新しい薬を見つける必要はありませんが、またそれらを見つける新しい方法を開発する必要があります結論につながっています。最も有望な候補の中でメソッドは、全体の生物、生体内でその使用の高スループット、表現型のリードアウトを試金して動脈分布線虫からその範囲をホストします。これらのホストには、ホストまたは biounavailable に有毒な化合物は、通常を高価なフォローする前に、最初の画面にドロップした時に誤検出での劇的な削減を含むいくつかの強力な利点があります。

ここで我々 の分析が定評のc. の elegansのホスト変化を調査する使用されている方法を紹介-緑膿菌液殺害病態システム。よく働いたこの技術のいくつかの拡張機能を紹介します。たとえば、我々 は 24 または 96 ウェルで RNAi を用いた高スループット遺伝スクリーンをこのホスト病原体の相互作用でクエリ ホスト要因にプレート フォーマットを運ぶことができます。この試金を使用して、可能性のある骨の折れるの生化学的な浄化方法を必要とせず、創薬のターゲットを識別するタスクを大幅に効率化できる、少数の月だけで全ゲノム スクリーンを完了できます。

我々 もここでグラム陰性病原菌のグラム陽性菌腸球菌を代替となる手法の変化を報告します。ずっとの場合に、腸球菌による殺害は時間依存です。以前c. の elegansのとは異なり、腸球菌の試金、我々 の分析腸球菌は、preinfection を必要としない、その安全性の向上、液体処理機器の汚染の可能性を減らすこと。試金は非常に堅牢な 〜 95% 死亡率 96 h ポスト感染を示します。

Introduction

身分証明書と有効な広域スペクトル抗生物質の開発今ほぼ世紀前に、公衆衛生における重要な分岐点につながった病気は過去の惨劇になる感染が広まった信念があった。いくつかの短い十年以内この楽天主義は病原体病原体がこれらの一度奇跡的な治療法が限られて抵抗機構を開発した後として、衰え始めた。いくつかの時間のため、薬剤の発見の努力と病原体の間の軍拡はバランスの取れたように見えた。しかし、抗菌薬の誤用は最近肺炎桿菌アシネトバクター属 baumaniiセラチア、および1、パン薬剤耐性菌の出現に結実して 2,3,4

は、人免疫不全状態、または嚢胞性線維症のある重症の熱傷患者へ深刻な脅威である日和見のグラム陰性、マルチホスト菌です。それはまたますます特に抗菌薬耐性の継続的な買収のための深刻な院内感染の原因となるエージェントとして識別されます。この脅威に対処するには、我々 は、定評のc. の elegans感染システム5を使用しています。私たちの研究室6ホストを殺すために病原体の能力を制限する新規化合物を識別するために液体ベース、高スループット、高コンテンツ スクリーニング プラットフォームを開発するこのシステムが活用されています。興味深いことに, これらの化合物は抗菌剤7および病原性阻害剤8を含む少なくとも 3 つの一般的なカテゴリに属しているようです。線虫c.エレガンス他高コンテンツ薬物検出アッセイ結核菌 tuberculosum、クラミジア ・ トラコマチス、仮性結核菌、リステリア菌、野兎病菌、黄色ブドウ球菌、カンジダ ・ アルビカンス、報告されていると腸球菌、他の中で9,1011,12,13,14,,1516。これらの種類のアッセイのホストと病原体、化学画面とを超えてヒットを識別する能力に比べてバイオアベイラビリティの可能性の増大に有毒かもしれない誤検出の制限など、いくつかのよく知られている利点があります。単に反 virulents、免疫促進分子、またはそれ以外の場合前者を支持して宿主-病原体相互作用のバランスを傾ける化合物など、微生物の増殖を制限すること。さらに、これらの画面で発見された化合物は、哺乳類のホストで効果的。

それは、少なくとも 2 つ他の試金17,18が液体にc. の elegansの高スループット画面を実行する使用できることは注目に値するです。しかし、これらのアッセイのそれぞれは液体で実行する遅い殺害として知られている、典型的な腸の植民地化アッセイができる変更のスループットが向上しより容易に選別する化合物。慎重に評価は決定的な細菌の病原性のメカニズムがこれらの試金および液体ベースのスクリーン7間で異なっていることを示しています。病原性の両方のタイプは、哺乳類システムで観察される、ので、アッセイの選択前に実験者の利益に最も関連するどの病原性を規定を検討することが重要です。

液体ベースの最適化されたバージョンを示すC. elegans P. 緑膿菌の試金。グラム陽性の細菌の病原体に対応する液体を用いた測定手法の適応を述べる腸球菌のようなe. フェカリスますます深刻な院内の脅威として抗菌薬耐性経路1の成長している兵器で識別されます。腸球菌の高速スクリーニング法の前に14が存在する病原体は、手順が複雑になりますし、COPAS FlowSort のような機器に汚染の可能性が高くなると preinfection が必要です。提案プロトコルの安全性プロファイルを改善、感染前の必要があります。最後に、これらのアッセイのいずれかは、確立の役割を果たすホストの要因を検索するユーザーを許可する RNAi や感染に対する抵抗性を餌と併用できる手段を報告します。

Protocol

注意:膿と腸球菌バイオ セーフティ レベル 2 の病原体は、偶発的な感染を防ぐため、表面の汚染を最小限に抑えるため、適切な安全対策が取られなければなりません。すべてのメディアや病原体と接触する材料を滅菌または破棄する必要があります。CDC の文書バイオ セーフティの微生物学的および生物医学研究所 (BMBL)、第 5 版からさらにガイドラインがあります。 <p class="j…

Representative Results

分析パフォーマンスのための重要なパラメーター トラブルシューティングと分析を最適化するために必要なこの試金の基礎となる生物学の正しい理解が。そのために、私たちを参照してください最初いくつか主要なペーパー,緑膿菌の発症のメカニズムを解明-リキッド7,<sup class="xref"…

Discussion

この試金 (または他の病原体が腸球菌の代わりに使用と同様の試金)、様々 な創の目的に役立ちます。また、特定病原因子、ホストの防衛の経路の解明と宿主-病原体相互作用に関わる規制機械を決定するなどの基本的な生物学的問題に対処するため便利です。

液殺害アッセイは、堅牢な失敗の可能性を最小限に抑えるための細心の注意の支払わ…

Açıklamalar

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

この研究は、がんの予防およびテキサスの研究所 (CPRIT) 賞 RR150044、ウェルチ財団研究助成金 C-1930 年、国立機関の健康 K22 AI110552 NVK に授与、支えられました。資金提供者には、研究デザイン、データ収集と分析、意思決定を発行し、または原稿の準備の役割はなかった。

Materials

COPAS FP BioSorter Union Biometrica Large object flow cytometer/worm sorter
Cytation 5 BioTek
EL406 Washer Dispenser BioTek
Multitron Pro Infors HT
24 Deep-Well RB Block Thermo Fisher Scientific CS15124
384-Well plate Greiner Bio-One MPG-781091
Nematode Growth Media (NGM) Amount per liter: 18 grams agar, 3 grams NaCl, 2.5 grams Peptone, 1 mL CaCl2 (1 M), 1 mL MgSO4 (1 M), 25 mL Phospate buffer, and 973 mL of milli-Q water
Slow Killing (SK) plates Amount per liter: 18 grams agar, 3 grams NaCl, 3.5 grams Peptone, 1 mL CaCl2 (1 M), 1 mL MgSO4 (1 M), 25 mL Phospate buffer, and 973 mL of milli-Q water
Slow Killing (SK) media Amount per liter:  3 grams NaCl, 3.5 grams Peptone, 1 mL CaCl2 (1 M), 1 mL MgSO4 (1 M), 25 mL Phosphate buffer, and 973 mL of milli-Q water
Lysogeny Broth (LB) USBiological Life Sciences L1520
Brian Heart Infusion broth (BHI) Research Products International Corp 50-488-526
Worm Bleach Solution Amount per 100 mL: 10 mL of 5 M NaOH solution, 20 mL of 5% Sodium Hypochlorite Solution, and 70 mL of sterile water
S Basal Amount per liter: 5.85 grams NaCl, 6 grams KH2PO4, 1 gram K2HPO4, and 1 Liter of milli-Q water
Agar USBiological Life Sciences A0930
NaCl USBiological Life Sciences S5000
Peptone USBiological Life Sciences P3300
CaCl2 USBiological Life Sciences
MgSO4 Fisher Scientific M63-500
Phospate buffer amount per liter: 132 mL of K2HPO4 (1M) and 868 mL of KH2PO4 (1M)
KH2PO4 Acros Organics 7778-77-0
K2HPO4 USBiological Life Sciences P5100
5% Sodium Hypochlorite Solution BICCA 7495.5-32
NaOH solution Fisher Scientific SS255-1
Breathe-easy Diversified Biotech BEM-1
SYTOX Orange Nucleic Acid Stain Fisher Scientific S11368
Bacterial Strains
P. aeruginosa (PA14)
E. faecalis(OG1RF)
E. coli superfood (OP50)
E. coli RNAi expressing bacteria (HT115)
Worm Strains
glp-4(bn2) (Beanan and Strome, 1992, PMID: 1289064)
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