여기, 선물이 분리 하 고 특성 구조, 후 각 힘, 및 바다 lampreys의 상 상속 페로몬 화합물의 행동 응답 프로토콜.
검정 안내 분별 분리와 활성 페로몬 화합물의 식별 가이드 생리 및 행동 생물 검정의 결과 사용 하는 반복적인 접근 방식을입니다. 이 방법은 다양 한 동물 종에에서 페로몬으로 그 기능 화학 신호의 성공적인 특성에 결과 있다. 바다 lampreys 행동 또는 생리 적인 응답을 중재 하는 페로몬을 감지 하는 후각이에 의존 합니다. 우리 상 상속 페로몬의 기능을 멋 부리 다 하 고 절연 및 활성 페로몬 구성 요소 식별 가이드 물고기 생물학의이 지식을 사용 합니다. 크로마토그래피는 추출, 집중, 바른된 물에서 화합물을 분리 하는 데 사용 됩니다. 전기-olfactogram (EOG) 녹음 어떤 분수 유도 후 각 응답을 결정 하기 위해 수행 됩니다. 2 선택 미로 행동 분석 다음 경우 향기가 있는 분수의 또한 행동 활성화 되며 특혜를 유도 결정 하는 데 사용 됩니다. Spectrometric 및 광 메서드는 분자량 및 구조 설명 지원 구조 정보를 제공 합니다. 순수한 화합물의 bioactivity EOG 및 행동 분석 실험으로 확인 된다. 미로에서 관찰 된 행동 응답 궁극적으로 자연 스트림 환경에서 그들의 기능을 확인 하는 필드에에서 확인 되어야 합니다. 이러한 생물 검정 1) 분류 과정을 안내 하 고 2) 확인을 이중 역할 추가 격리 된 구성 요소 bioactivity를 정의 하 고. 여기, 우리는 검정 기반 분류 방식의 유틸리티를 예증 해 심고 페로몬 식별의 대표적인 결과 보고 합니다. 식별 해 심고 페로몬의 페로몬 통신 시스템의 변조 침략 바다 심고 Laurentian 오대호에서 제어 하는 것으로 간주 하는 옵션 중 하나입니다 있기 때문에 특히 중요 하다. 이 메서드는 taxa의 광범위 한 배열에서 화학 커뮤니케이션 특성 및 waterborne 화학 생태학에 쉽게 적응 될 수 있다.
페로몬은 특정 화학 신호 음식 소스를 찾는, 포식 자 감지 conspecifics1의 사회적 상호 작용을 중재에 그들을 원조 하는 개인에 의해 발표. 곤충에 페로몬 통신이 되었습니다 잘 공부2; 그러나, 화학 물질 식별 및 수생 척추 동물 페로몬의 생물 학적 기능 하지 되었습니다 공부 했다으로 광범위 하 게. 정체성의 지식과 발표 페로몬의 기능 위협된 종3,4 또는 제어 해충 종5,6의 복구를 촉진 하기 위하여 적용할 수 있습니다. 이러한 기술의 응용 프로그램 격리 및 생리 활성 페로몬 구성 요소 특성화를 필요로합니다.
페로몬 식별 천연 제품 화학의 지점 이다. 페로몬 연구에 진행 부분적으로 페로몬 분자 자체의 특성으로 인해 제한 되었습니다. 페로몬은 종종 불안정 하 고 소량, 출시 그리고 몇 가지 샘플링 기술을 분 양의 휘발성7,8 또는 수용 성 화합물9를 감지 하 존재. 페로몬을 식별 하는 방법 1) 알려진된 화합물, 2) 대사체학, 및 3) 검정 안내 분별의 대상된 심사를 포함 합니다. 알려진된 화합물의 대상된 심사 페로몬 기능을 가상 하는 생리 적 프로세스의 상용 대사 부산물을 테스트 합니다. 연구원은 알려진 및 사용 가능한 화합물 테스트할 수 있기 때문에이 접근은 제한 하 고 있다. 그러나, 그것은 결과가 금붕어에 성 호르몬의 성공적인 식별 기능을 페로몬10,,1112. 대사체학은 생물 학적 시스템13내에서 잠재적인 작은 분자 대사 제품을 구별 하는 두 번째 페로몬 식별 접근 이다. 두 그룹 (즉,는 활성 및 비활성 추출 물)의 신진 대사 프로필의 비교 수는 잠재적인 신진 대사 프로필의 식별 하는 대사 산물은 정화에서 구조는 해명, 그리고 bioactivity는 확인 된14. 특정 혼합물의 복잡 한 공식의 첨가제 또는 시너지 효과 대사체학 metabolites 분수13의 시리즈로이 아닌 함께 간주 됩니다 때문에 발견 될 더 높습니다. 그러나, 대사체학의 구현 결과 데이터 소설 구조의 설명을 촉진 하지 않습니다 때문에 합성 참조의 가용성에 의존 합니다.
검정 안내 분별은 두 분야에 걸쳐 통합, 반복 접근: 화학 및 생물학. 이 방법은 생리 및 행동 생물 검정의 결과 사용 하 여 격리 및 활성 페로몬 화합물의 식별 가이드. 원유 추출 화학 속성 (즉, 분자 크기, 극성, 등)에 의해 분류 한 이며 전기-olfactogram (EOG) 녹음 및는 생물 검정에 테스트. 생리 활성 구성 요소 분류 및 EOGs 생물 검정의이 단계를 반복 하 여 밖으로 상영 됩니다. 순수한 활성 화합물의 구조는 분자량 및 합성 화합물의 템플릿을 생산 구조 정보 제공 spectrometric 및 분 광 방법으로 해명. 생물 검정 기반 분류 다양 한 대사와 생 합성 경로에서 예측 될 것 하지 않은 독특한 화학 뼈대와 잠재적으로 소설 페로몬을 얻을 수 있습니다.
여기, 우리는 분리 남성 바다 심고 섹스 페로몬 화합물의 bioactivity 특성을 사용 하는 검정 기반 분류 프로토콜을 설명 합니다. 바다 심고 (Petromyzon 리누스)이이 물고기는 그들의 anadromous 생활사는 3 단계로 구성 된 중재 화학 신호의 후 각 탐지에 크게 의존 하기 때문에 페로몬 커뮤니케이션을 공부 하는 이상적인 척추 모델은: 애벌레, 청소년, 그리고 성인입니다. 바다 심고 애벌레 민물 스트림 앙금으로 뚫으, 과감 한 변 태를 받아야 하 고 호수 또는 바다 어디 그들은 큰 호스트 물고기 parasitize 이주 청소년으로 변환. 호스트 물고기에서 분리 후 성인 마이그레이션할 다시 산란 스트림, 스트림 상주 애벌레15,,1617,18,19 발표 철새 페로몬에 의해 유도 . 성숙한 남성 산란 지상에 승천, 동료를 유치, 약 일주일 동안 간헐적으로 산란 다음 죽을15,20을 다 성분 섹스 페로몬을 릴리스 합니다. 식별 해 심고 페로몬의 페로몬 통신 시스템의 변조 Laurentian 오대호21에서 침략 적 바다 lampreys 제어 하는 것으로 간주 하는 옵션 중 하나입니다 있기 때문에 중요 하다.
물고기는 화합물의 아직 식별 전체 화학 세계에 살고 있습니다. 생물 검정 기반 분류 특징 masu 연어31,32, 아시아 코끼리 바다 lampreys33, 관찰 등 많은 화학적 상호 작용을 중재 하는 생리 활성 분자를 식별 하는 필수 입증 34,35. 검정 안내 분별 정확 하 게 추적 및 pinpoint 시작에서 생리 활성 화?…
The authors have nothing to disclose.
우리는 미국 지질 조사 하 몬 드 베이 생물학 역 그들의 연구 시설 사용 및 미국 어류 및 야생 동물 서비스 및 수 산업의 직원 및 바다 캐나다 바다 lampreys 제공 하기 위한 감사 합니다. 이 연구는 웨이 밍 리와 애 리 대 호 어업 위원회에서 교부 금에 의해 지원 되었다.
Premium standard wall borosilicate capillaries with filament | Warner Instruments | G150F-4 | recording and reference electrode (OD 1.5 mm, ID 0.86 mm) |
Pipette puller instrument | Narishige | PC-10 | pulls electrodes for EOGs |
Diamond-tipped glass cutter | Generic | cut tip of electrodes for EOG | |
Borosilicate glass capillaries | World Precision Instruments | 1B150-4 | odorant delivery tube for EOG |
Recording electrode holder E Series straight body with Ag/AgCl pellet for glass capillary OD 1.5 mm | Warner Instruments | ESP-M15N | recording electrode holder |
Reference electrode holder E Series with handle with Ag/AgCl pellet for glass capillary OD 1.5 mm | Warner Instruments | E45P-F15NH | reference electrode holder |
1 mm pin | Warner Instruments | WC1-10 | to bridge reference and recording electrode holders |
2 mm pin | Warner Instruments | WC2-5 | to bridge reference and recording electrode holders |
Agar | Sigma | A1296 | molten agar to fill electrodes |
Potassium chloride (KCl) | Sigma | P9333 | 3M KCl to fill electrodes and electrode holders |
Micropipette microfil | World Precision Instruments | MF28G-5 | to fill electrodes and electrode holders |
L-Arginine | Sigma | A5006 | positive control odorant for EOG |
Methanol | Sigma | 34860 | |
Water bath | Custom made | N/A | holds odorants for EOG |
3-aminobenzoic acid ethyl ester (MS222) | Syndel USA | Tricaine1G | EOG anesthetic |
Gallamine triethiodide | Sigma | G8134-5G | EOG paralytic |
1 mL syringe | BD Biosciences | 301025 | to administer paralytic |
Subcutaneous needle 26G 5/8 | BD Biosciences | 305115 | to administer paralytic |
Roller clamp | World Precision Instruments | 14043-20 | adjust flow rate of anesthic into lamprey's mouth |
Sodium chloride (NaCl) | J.T. Baker | 3624-05 | for preparation of 0.9% saline |
V-shaped plastic stand as specimen stage | Custom made | N/A | holds lamprey during EOG |
Plastic trough | Custom made | N/A | holds V-shaped plastic stand during EOG |
Scalpel Blades – #11 | Fine Science Tools | 10011-00 | for EOG dissection |
Scalpel Handle – #3 | Fine Science Tools | 10003-12 | for EOG dissection |
Straight ultra fine forceps | Fine Science Tools | 11252-00 | for EOG dissection, Dumont #5SF Forceps |
Curved ultra fine forceps | Fine Science Tools | 11370-42 | for EOG dissection, Moria MC40B |
Straight pring Scissors | Fine Science Tools | 15003-08 | for EOG dissection |
Stereomicroscope | Zeiss | Discovery V8 | for EOG dissection |
Illuminator light | Zeiss | CL 1500 ECO | for EOG dissection |
Plastic tubing | Generic | to connect re-circulating EOG setup and water baths | |
Odorant delivery tubing | Custom made | N/A | |
In line filter and gasket set | Lee Company | TCFA1201035A | |
Micromanipulators | Narishige | MM-3 | to position electrodes and odorant delivery capillary tube |
Magnetic holding devices | Kanetec | MB-K | |
Valve driver | Arduino | custom made | to control the opening of the valve for odor stimulation |
Electromagnetic valve | Lee Company | LFAA1201618H | valve for odor stimulation |
NeuroLog AC/DC amplifier | Digitimer Ltd. | NL106 | to increase the amplitude of the elictrical signal |
NeuroLog DC pre-amplifier with headstage | Digitimer Ltd. | NL102G | to increase the amplitude of the elictrical signal |
Low-pass 60 Hz filter | Digitimer Ltd. | NL125 | |
Digitizer | Molecular Devices LLC | Axon Digidata 1440A | |
Dell computer (OptiPlex 745) running Axoscope data acquistion software | Molecular Devices LLC | AxoScope version 10.4 | |
Faraday cage | Custom made | N/A | Electromagnetic noise shielding |
Two-choice maze | Custom made | N/A | waterproofed marine grade plywood covered with plastic liner |
Trash pump | Honda | WT30XK4A | fills maze with water from nearby river |
Peristaltic pump with tubing | Cole Parmer | Masterflex 07557-00 | to adminster odorants in maze |
Inverter Generator | Honda | EU1000i | powers perstaltic pump |
Release cage | Custom made | N/A | used to acclimate lamprey in the maze |
Mesh | Generic | used to contain the dimensions of the maze and minimize water turbulance with mesh rollers | |
Buckets (5 gallon) | Generic | to mix odorants | |
Flow meter | Marsh-McBirney | Flo-Mate 2000 | to measure discharge |
XAD 7 HP resin | Dow chemical | 37380-43-1 | for extraction of conditioned water |
Methanol | Sigma | 34860 | for extraction of conditioned water |
Water bath | Yamato | BM 200 | for extraction of conditioned water |
Freeze dryer | Labconco | CentriVap Concentrator | for extraction of conditioned water |
chloroform | Sigma | CX1050 | for isolation of fraction pools |
Silica gel 70-230 mesh | Sigma | 112926-00-8 | for isolation of fraction pools |
Silica gel 230-400 mesh | Sigma | 112926-00-8 | for isolation of fraction pools |
Pre-coated silica gel TLC plates | Sigma | 99571 | for isolation of fraction pools |
anisaldehyde | Sigma | A88107 | for isolation of fraction pools |
Sephadex LH-20 | GE Healthcare | 17-0090-01 | for isolation of fraction pools |
Amberlite XAD 7 HP resin | Sigma | XAD7HP | for extraction of conditioned water |
4, 2.5L capacity glass columns | Ace Glass Inc. | 5820 | for extraction of conditioned water |
Acetone | Sigma | 650501 | for extraction of conditioned water |
TQ-S TOF LC Mass spectrometer (or equivalent) | Waters Co. | N/A | for structure elucidation |
Binary HPLC pump | Waters Co. | 1525 | for isolation of fraction pools/compounds |
Agilent NMR spectrometer, 900MHz (or equivalent) | Agilent | N/A | for structure elucidation |
Rotovap drying system | Buchi | RII | for extraction of conditioned water |
UV lamp (254 nm) | Spectronics Co. | ENF-240C | for thin layer chromatography |