В статье описывается оптимизированный протокол для приготовления жизнеспособных ткани мозга гипофизарной ломтиками, используя костистых рыб оризии (Oryzias latipes), следуют электрофизиологических записи гипофиза клеток с использованием метода патча зажим с перфорированные патч конфигурации.
Электрофизиологические исследования гипофиза клеток были проведены в многочисленных видов позвоночных, но очень немногие костистых рыб. Среди них явное большинство выполнены на диссоциированных первичной клетки. Чтобы улучшить наше понимание как костистых клеток гипофиза, ведут себя в более биологически соответствующие среде, этот протокол показано, как подготовить жизнеспособных мозга гипофизарной фрагментов с помощью мелких пресноводных рыб оризии (Oryzias latipes). Делая срезы мозга гипофиза, pH и осмотического давления всех решений были скорректированы для значения, найденные в жидкостях организма пресноводных рыб, живущих в 25-28 ° C. После подготовки срез протокол демонстрирует проводить электрофизиологических записей с использованием метода перфорированные поклеточного патч зажим. Патч зажим техника является мощным инструментом с беспрецедентной временное разрешение и чувствительность, позволяя исследования электрических свойств от нетронутыми все клетки до одного ионных каналов. Перфорированные патч является уникальным в том, что он держит внутриклеточной среды, нетронутыми предотвращая будучи разбавленным раствором электрода пипеткой патч регуляторных элементов в цитозоль. В противоположность этому при выполнении традиционных поклеточного записи, было отмечено, что оризии гипофиза клетки быстро теряют способность огонь потенциалы действия. Среди различных имеющихся методов перфорации этот протокол демонстрирует достижения перфорация пропатчен мембраны, используя фунгицидом амфотерицин B.
Гипофиза является ключевым эндокринного органа в позвоночных расположен ниже гипоталамуса и кзади зрительных нервов. Она производит и выделяет гормоны, шесть-восемь из типов конкретных клеток. Гормоны гипофиза являются промежуточным между мозга и периферических органов и управлять широкий спектр основных физиологических процессов, включая рост, размножение и регуляции гомеостаза. Подобно нейронов, эндокринных клеток гипофиза электрически возбудимых с возможностью спонтанно огонь потенциалы действия 1. Роль этих действий потенциалов является зависимой ячейки. В нескольких типах клеток млекопитающих гипофиза потенциалы действия может поднять внутриклеточных Ca2 + достаточно для стабильного выпуска гормона 2. Кроме того гипофиза получает как стимулирующее, так и тормозящий информацию от головного мозга, которое затрагивает мембранного потенциала клеток 3,4,5,6. Как правило стимулирующее ввода увеличивает возбудимость и часто включает в себя выпуск Ca2 + от внутриклеточного магазинов а также увеличилась, выпустив частоты 7. Понимание как ячейка использует канал ионного состава и приспосабливается к этим входных сигналов от мозга является ключом к пониманию синтез гормонов и выпуска.
Патч зажим техника была разработана в конце 70-х годов Сакман и Неер 8,9,10 и дальнейшего улучшения Хэмилл 11и позволяет детальные исследования электрофизиологических свойств клеток вплоть до одного ионных каналов. Кроме того этот метод может использоваться для изучения тока и напряжения. Сегодня патч зажима является золотым стандартом для измерения электрофизиологических свойств ячейки. Четыре основных конфигураций герметичное уплотнение патч зажим техники были развитые 11; клетки придает, изнутри наружу, снаружи out и поклеточного патч. Три первых конфигурации обычно используются для одной ионного канала расследований. Четвертое, после придает ячейки конфигурации отверстие в клеточной мембраны производится с использованием югу атмосферного давления. Эта конфигурация также позволяет исследования ионного канала состава клеточных 12. Однако одним ограничением этой методики является, что цитоплазматических молекулы разводят патч пипеткой решение 13 (рис. 1А), влияя таким образом на электрических и физиологические реакции исследованных клеток. Действительно некоторые из этих молекул может играть важную роль в трансдукции сигнала или в регуляции различных ионных каналов. Чтобы избежать этого, Линдау и Фернандес 14 разработал метод где поры формирование соединения добавляется к патч пипеткой. После конфигурации придает ячейки соединение будет включать в плазматической мембраны под патч и медленно перфорировать мембраны, создание электрического контакта с цитозоле (рис. 1Б). Можно использовать несколько различных противогрибковые препараты, такие как нистатин 15 и амфотерицин B 16, или поверхностно-активных веществ, как сапонины бета эсцин 17,18 . Эти соединения создают поры достаточно большой, чтобы позволить моновалентной катиона и Cl– диффузии между цитозоле и патч пипеткой при сохранении цитозольной уровни макромолекул и больше ионов как Ca2 + 15, 16.
Проблема использования перфорированной патч является потенциально высокой серии сопротивление. Последовательное сопротивление (Rs) или доступ сопротивление является комбинированных сопротивления над патч пипеткой по отношению к земле. Во время записи патч зажим, Rs будет параллельно с мембраной сопротивления (Rm). M R и Rs в параллельной работы как Делитель напряжения. С высокой Rs, напряжение упадет Rs давая ошибки в записи. При больших токах Записанная ошибка станет больше. Кроме того делителя напряжения является частота зависит от создания НЧ-фильтр, таким образом затрагивающих временное разрешение. По сути перфорированные патч может не всегда позволяют записи крупных и быстрых течений как напряжение закрытого Na+ токи (более подробные показания см ссылку 19). Кроме того Rs может варьироваться во время записи патч зажим, снова ведет к изменениям в текущей записи. Таким образом ложных срабатываний может возникнуть в ситуациях, когда Rs изменения во время применения препарата.
Электрофизиологии на кусочки ткани был впервые представлен Андерсен лаборатории по изучению электрофизиологических характеристик нейронов в мозге 20. Техника проложили путь для подробного исследования одной клетки, а также связи и ячейки схемы ячеек в среде более нетронутыми. Подобный метод для изготовления гипофиза ломтики был представлен в 1998 году Guérineau et al. 21. Однако, он не был до 2005 года, что подготовка мозга гипофизарной срез был успешно используется для исследования патч зажим в костистых 22. В этом исследовании авторы также сообщили об использовании перфорированных патч зажим записей. Однако на сегодняшний день, большинство электрофизиологических исследований гипофиза клетки были проведены в млекопитающих и только горстка других позвоночных, включая костистых рыб 1,2,22,23 . В teleosts почти все исследования были проведены на первичной диссоциированных клетки 24,25,26,27,28,29,30 .
В настоящем документе мы наметим оптимизированный протокол для приготовления здорового мозга гипофизарной фрагментов из рыбы оризии модели. Этот подход представляет собой ряд преимуществ, по сравнению с первичной диссоциированных клеточных культур. Во-первых клетки, записываются в среде относительно сохранились, по сравнению с отделить условий культуры клеток. Во-вторых ломтик препараты позволяют нам учиться косвенных путей, посредничестве ячеек связи 22, что невозможно в условиях культуре диссоциированных клеток. Кроме того мы показали, как проводить электрофизиологических записей на ломтики полученные тканей, с использованием метода перфорированные поклеточного патч зажим с амфотерицин в качестве агента порами формирования.
Оризии является небольшой пресноводных рыб, родом из Азии, главным образом найдены в Японии. Физиологии, эмбриологии и генетики оризии были широко изучены для более чем 100 лет 31, и это часто используемые исследовательской модели во многих лабораториях. Особое значение для этого документа является организация различных морфологических гипоталамус гипофиз комплекса в костистых рыб: в то время как в млекопитающих и птиц нейронов гипоталамуса освободить их нейро гормоны, регулирующие гипофиза эндокринные клетки в систему портала средний возвышение существует прямой нервной проекции нейронов гипоталамуса на эндокринные клетки гипофиза в 32костистых рыб. Таким образом тщательно проведенных нарезки гипофиза мозга имеет особое значение в рыбе, что позволяет нам исследовать электрофизиологических характеристик гипофиза клетки в хорошо сохранившейся сети гипофиза мозга и в частности как гипофиза клетки контролировать их возбудимости и тем самым Ca2 + гомеостаза.
Электрофизиологические записей с использованием метода патча зажим на срезах головного мозга гипофизарной требуют тщательной оптимизации. Хорошо оптимизированный протоколы для проведения расследований клеток специально в teleosts ограничены, с большинством публикаций с помощью прото?…
The authors have nothing to disclose.
Мы благодарим г-жа Тан G LourdesCarreon за ее помощь, поддержание объекте оризии и Энтони Пельтье для иллюстративных цифр. Эта работа финансировалась путем NMBU и исследовательский совет Норвегии, номера грантов 244461 (аквакультуры программы) и 248828 (Цифровая жизнь Норвегии программа).
Vibratome | Leica | VT1000 S | |
Chirurgical glue | WPI | VETBOND | 3M Vetbond Tissue Adhesive |
Stainless steel blades | Campden Instruments | 752-1-SS | |
metal molds | SAKURA | 4122 | |
steel harp | Warner instruments | 64-1417 | |
PBS | SIGMA | D8537 | |
Ultrapure LMP agarose | invitrogen | 166520-100 | |
patch pipettes | Sutter Instrument | BF150-110-10HP | Borosilicate with filament O.D.:1.5mm, I.D.:1.10mm |
Microscope Slicescope | Scientifica | pro6000 | |
P-Clamp10 | Molecular Devices | #1-2500-0180 | sofware |
Digitizer Digidata 1550A1 | Molecular Devices | DD1550 | |
Amplifier Multiclap 700B Headstage CV-7B | Molecular Devices | 1-CV-7B | |
GnRH | Bachem | 4108604 | H-Glu-His-Trp-Ser-His-Gly-Leu-Ser-Pro-Gly-OH trifluoroacetate salt |
pipette puller | Sutter Instrument | P-1000 | |
amphotericin B | SIGMA | A9528 | pore-forming antibiotic |
polyethylenimine | SIGMA | P3143 | 50% PEI solution |
microfiler syringe | WPI | MF28/g67-5 | |
glass for the agar bridge | Sutter Instrument | BF200-116-15 | Borosilicate with filament O.D.:2.0mm, I.D.:1.16mm Fire polished |
Micro-Manager software | Open Source Microscopy Software | ||
optiMOS sCMOS camera | Qimaging | 01-OPTIMOS-R-M-16-C | |
sonicator | Elma | D-7700 singen | |
NaCl | SiGMA | S3014 | |
KCl | SiGMA | P9541 | |
MgCl2 | SiGMA | M8266 | |
D-Glucose | SiGMA | G5400 | |
Hepes | SiGMA | H4034 | |
CaCl2 | SiGMA | C8106 | |
Sucrose | SiGMA | 84097 | |
D-mannitol | SiGMA | 63565 | |
MES-acid | SIGMA | M0895 | |
BSA | SIGMA | A2153 |