Özet

معالجات الجينوم الإدخال تسلسل إعداد مكتبة من عينة تارديجرادي واحد

Published: July 15, 2018
doi:

Özet

التلوث أثناء تسلسل الجينوم للكائنات الحية المجهرية لا يزال يمثل مشكلة كبيرة. هنا، نعرض طريقة لتسلسل الجينوم من تارديجرادي من عينة واحدة مع pg 50 أقل قدر من الحمض النووي دون تضخيم الجينوم كله التقليل من مخاطر التلوث.

Abstract

تارديجراديس هي الحيوانات المجهرية التي تدخل دولة أميتابوليك تسمى أنهيدروبيوسيس عندما تواجه جفاف ويمكن العودة إلى حالتها الأصلية عندما يتم توفير المياه. تسلسل الجينوم من الحيوانات المجهرية مثل تارديجراديس مخاطر التلوث البكتيري في بعض الأحيان يؤدي إلى تفسيرات خاطئة، على سبيل المثال، فيما يتعلق بمدى نقل الجينات الأفقي في هذه الحيوانات. هنا، نحن نقدم أسلوب إدخال معالجات تسلسل جينوم تارديجرادي، دوجارديني هيبسيبيوس، من عينة واحدة. عن طريق استخدام الاستبعاد الغسيل والتلويث صرامة جنبا إلى جنب مع كفاءة استخراج من 50 ~ 200 pg المجينية الحمض النووي من فرد واحد، ونحن شيدت مكتبة التسلسل مع أداة تسلسل الحمض النووي. هذه المكتبات تم استنساخه للغاية وغير منحازة، وأظهر تحليل المعلوماتية من يقرأ التسلسل مع مورثات أخرى H. دوجارديني الحد أدنى من التلوث. يمكن تطبيق هذا الأسلوب إلى ايضات تارديجراديس التي يمكن أن لا تكون متسلسلة باستخدام الطرق السابقة.

Introduction

تارديجراديس هي الحيوانات المجهرية التي يمكن أن تدخل دولة أميتابوليك تسمى أنهيدروبيوسيس عندما تواجه جفاف. أنها استعادة بامتصاص المياه1،2. في حالة أميتابوليك، تارديجراديس قادرة على التغاضي عن مختلف البيئات المتطرفة، التي تشمل درجات الحرارة القصوى3 والضغوط4،5، وجرعة عالية من الضوء فوق البنفسجي6والأشعة السينية وأشعة غاما 7 , 8و9من الفضاء الكوني. بيانات الجينوم أساس لا غنى عنه لدراسة الآليات الجزيئية أنهيدروبيوسيس.

المحاولات السابقة لتسلسل جينوم تارديجراديس أظهرت علامات التلوث البكتيري10،11،12،،من1314. تسلسل الجينوم من هذه الكائنات الصغيرة يتطلب عدد كبير من الحيوانات، وهو عرضه للتلوث البكتيري؛ ولذلك، فقد أنشأنا سابقا بروتوكول تسلسل باستخدام أسلوب إدخال معالجات بدءاً من عينة واحدة من تارديجرادي، للتقليل من مخاطر التلوث15. باستخدام هذه البيانات، كما أجرينا resequencing عالية الجودة وإعادة التجميع للجينوم من16، H. دوجارديني17. هنا نحن تصف بالتفصيل هذا الأسلوب لتسلسل الجينوم من فرد واحد تارديجرادي (الشكل 1). التحقق من الصحة لهذا الأسلوب التسلسل هو أبعد من التركيز في هذه الورقة، وسبق مناقشة مستفيضة في أعمالنا السابقة التقرير16.

ويتكون هذا الأسلوب من جزأين: عزل تارديجرادي واحد مع أدنى ممكن التلوث، واستخراج عالية الجودة للرسم التخطيطي مستويات الحمض النووي. Tardigrade جوعاً وتشطف جيدا مع الماء، فضلا عن المضادات الحيوية، ولاحظ تحت مجهر مع 500 X التكبير لضمان إزالة أي تلوث جرثومي. وتظهر التقديرات السابقة والقياسات أن فرد واحد من تارديجرادي يحتوي على حوالي 50-200 pg المجينية الحمض الخلوي الصبغي16، الذي يستخرج من تكسير الهيكل الخارجي كيتين بدورات تجميد أذاب أو بواسطة التذويب اليدوي. هذا الحمض النووي هو المقدمة لبناء مكتبة ومتسلسلة على أداة تسلسل الحمض النووي. ويبين تحليل المعلوماتية إضافية تسلسل عالية الجودة، فضلا عن تدني مستويات التلوث بالمقارنة مع المشاريع السابقة في تسلسل تارديجرادي.

Protocol

1-إعداد إعداد 2% [اغروس] هلام استخدام الماء المقطر (DW) المذيب في صحن الثقافة بلاستيكية عيار 90 ملم، و 10 مل من 1% البنسلين/ستربتوميسين كوكتيل مع دويتشه فيلة. ويمكن تخزين الهلام لمدة 2-3 أسابيع في حاضنة في 18 درجة مئوية.ملاحظة: تجنب أي مخزن من جل أقل من 10 درجة مئوية، لدرجة الحرارة المنخفضة سوف …

Representative Results

استبعاد المواد الملوثة: ينطوي هذا البروتوكول غسيل دقيق تارديجرادي وتعقيم مع العلاج المضادات الحيوية لتقليل التلوث. كما أنها تنطوي عملية فحص البصري ضمان اكتمال هذه العمليات. ويبين الشكل 2صورة مجهر أثناء التحقق م?…

Discussion

التلوث البكتيري يشكل تهديدا لتسلسل الجينوم للكائنات الحية المجهرية. بينما قد تخرج الدراسات السابقة في تسلسل الجينوم تارديجرادي التلوث باستخدام أساليب المعلوماتية الواسعة12،20، نحن تسلسل الجينوم من فرد واحد التقليل من مخاطر التلوث. حيث يحتوي على حوالي 50-200 p…

Açıklamalar

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

يشكر المؤلفون تاكاي يوكي أبي نوزومي وايشي وناهوكو لدعمها التقني في تسلسل الجينوم. هذا العمل وأيده معونات “الجمعية اليابانية” لتعزيز العلوم (JSPS) زميل أبحاث ومعونات كاكينهي “العلماء الشباب” (No.22681029)، ومعونات كاكينهي للبحوث العلمية (ب) رقم 17 ح 03620 من JSPS، منحة “مشاريع بحوث العلوم الأساسية” من مؤسسة سوميتومو (No.140340)، وجزئياً من أموال البحث من حكومة محافظة ياماجاتا ومدينة تسروكا، اليابان. وزودت chlorella الشائع استخدامها لتغذية تارديجراديس المجاملة Chlorella المحدودة للصناعة

Materials

SZ61 microscope OLYMPUS
BactoAgar Difco Laboratories 214010
Penicillin Streptomycin (10,000 U/mL) Gibco by life technologies 15140-148
VHX-5000 System Keyence
0.2mL Silicone coating tube Bio Medical Science BC-bmb20200
Quick-DNA Microprep Kit ZYMO Research D3021 Use of this kit is absolutey critical; see step 3.1
1.5 mL microtube greiner bio-one 616-201 See 4.1.1
HIgh speed refrigerated micro centrifuge TOMY MX-307
Covaris M220 Covaris Inc. 4482277
ThruPLEX DNA-Seq kit Rubicon Genomics CAT. NO. R400406 Use of this kit is absolutey critical; see step 4.2
Thermal Cycler Bioer Technology TC-96GHbC
AMPure XP reagent BECKMAN COULTER Life Science A63881
Ethanol Wako 054-027335
EB buffer QIAGEN 19086
2200 TapeStation Agilent G2965AA 
D1000 Reagents Agilent 5067-5583
D1000 ScreenTape Agilent 5067-5582
Qubit dsDNA BR Buffer/Reagent ThermoFisher Scientific Q32850
Cubee Mini-Centrifuge RecenttecGenereach R5-AQBD01aqbd
MiSeq 600 cycle v3 Illumina Inc. MS-102-3003
MiSeq Sequencer Illumina Inc. SY-410-1003

Referanslar

  1. Crowe, J. H., Hoekstra, F. A., Crowe, L. M. Anhydrobiosis. Annual Review of Physiology. 54 (1), 579-599 (1992).
  2. Mobjerg, N., et al. Survival in extreme environments – on the current knowledge of adaptations in tardigrades. Acta Physiologica. 202 (3), 409-420 (2011).
  3. Becquerel, P. La suspension de la vieau dessous de 1/20 K absolu par demagnetization adiabatique de L’alun de fer dans le vide les plus eléve. Comptes Rendus de l’Académie des Sciences. 231, 261-264 (1950).
  4. Ono, F., et al. Effect of ultra-high pressure on small animals, tardigrades and Artemia. Cogent Physics. 3 (1), 1167575 (2016).
  5. Horikawa, D. D., et al. Tolerance of anhydrobiotic eggs of the Tardigrade Ramazzottius varieornatus to extreme environments. Astrobiology. 12 (4), 283-289 (2012).
  6. Horikawa, D. D., et al. Analysis of DNA repair and protection in the Tardigrade Ramazzottius varieornatus and Hypsibius dujardini after exposure to UVC radiation. PLoS One. 8 (6), e64793 (2013).
  7. Horikawa, D. D., et al. Radiation tolerance in the tardigrade Milnesium tardigradum. International Journal of Radiation Biology. 82 (12), 843-848 (2006).
  8. May, R. M., Maria, M., Gumard, J. Action différentielle des rayons x et ultraviolets sur le tardigrade Macrobiotus areolatus, a L’état actif et desséché. Bulletin Biologique de la France et de la Belgique. 98, 349-367 (1964).
  9. Jonsson, K. I., Harms-Ringdahl, M., Torudd, J. Radiation tolerance in the eutardigrade Richtersius coronifer. International Journal of Radiation Biology. 81 (9), 649-656 (2005).
  10. Bemm, F., Weiss, C. L., Schultz, J., Forster, F. Genome of a tardigrade: Horizontal gene transfer or bacterial contamination?. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (22), E3054-E3056 (2016).
  11. Delmont, T. O., Eren, A. M. Identifying contamination with advanced visualization and analysis practices: metagenomic approaches for eukaryotic genome assemblies. PeerJ. 4, e1839 (2016).
  12. Koutsovoulos, G., et al. No evidence for extensive horizontal gene transfer in the genome of the tardigrade Hypsibius dujardini. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (18), 5053-5058 (2016).
  13. Boothby, T. C., Goldstein, B., et al. Reply to Bemm et al. and Arakawa: Identifying foreign genes in independent Hypsibius dujardini genome assemblies. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (22), E3058-E3061 (2016).
  14. Boothby, T. C., et al. Evidence for extensive horizontal gene transfer from the draft genome of a tardigrade. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (52), 15976-15981 (2015).
  15. Arakawa, K. No evidence for extensive horizontal gene transfer from the draft genome of a tardigrade. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (22), E3057 (2016).
  16. Arakawa, K., Yoshida, Y., Tomita, M. Genome sequencing of a single tardigrade Hypsibius dujardini individual. Scientific Data. 3, 160063 (2016).
  17. Yoshida, Y., et al. Comparative genomics of the tardigrades Hypsibius dujardini and Ramazzottius varieornatus. PLoS Biology. 15 (7), e2002266 (2017).
  18. He, F. Total RNA Extraction from C. elegans. Bio-protocol. Bio101, e47 (2011).
  19. Andrews, S. . FastQC a quality-control tool for high-throughput sequence data. , (2015).
  20. Hashimoto, T., et al. Extremotolerant tardigrade genome and improved radiotolerance of human cultured cells by tardigrade-unique protein. Nature Communications. 7, 12808 (2016).
  21. Zimin, A. V., et al. The MaSuRCA genome assembler. Biyoinformatik. 29 (21), 2669-2677 (2013).
  22. Li, H., Durbin, R. Fast and accurate short read alignment with Burrows-Wheeler transform. Biyoinformatik. 25 (14), 1754-1760 (2009).
  23. Okonechnikov, K., Conesa, A., Garcia-Alcalde, F. Qualimap 2: advanced multi-sample quality control for high-throughput sequencing data. Biyoinformatik. 32 (2), 292-294 (2016).
  24. Horikawa, D. D., et al. Establishment of a rearing system of the extremotolerant tardigrade Ramazzottius varieornatus: a new model animal for astrobiology. Astrobiology. 8 (3), 549-556 (2008).

Play Video

Bu Makaleden Alıntı Yapın
Yoshida, Y., Konno, S., Nishino, R., Murai, Y., Tomita, M., Arakawa, K. Ultralow Input Genome Sequencing Library Preparation from a Single Tardigrade Specimen. J. Vis. Exp. (137), e57615, doi:10.3791/57615 (2018).

View Video