El objetivo de este protocolo es demostrar la inyección intra prostática de las células de cáncer de próstata, con la posterior castración. Modelos preclínicos ortotópico de cáncer de próstata andrógeno-dependiente y resistente a la castración son críticos para el estudio de la enfermedad en el contexto de un microambiente tumoral clínicamente relevante y un anfitrión inmunocompetente.
Ortotópico tumor modelación es una herramienta valiosa para la investigación del cáncer de próstata clínico previo, ya que tiene múltiples ventajas sobre ambos subcutáneo y transgénicos genéticamente modificados modelos de ratón. A diferencia de los tumores subcutáneos, tumores ortotópicos contienen vasculatura más clínico exacto, microambiente tumoral y respuestas a las terapias múltiples. En contraste a los modelos de ratón modificados genéticamente, orthotopic del modelos pueden realizarse con menor costo y en menos tiempo, implican el uso de ratón altamente complejo y heterogéneo o líneas celulares de cáncer humano, algo solo alteraciones genéticas y estas células las líneas pueden ser genéticamente modificados, como express agentes de imagen. Aquí, presentamos un protocolo quirúrgico inyectar una línea de células expresan luciferasa y mCherry murino de cáncer de próstata en el lóbulo anterior de la próstata de ratones. Estos ratones desarrollaron tumores de orthotopic que fueron monitorizados de forma no invasiva en vivo y más analizan en el volumen del tumor, peso, supervivencia del ratón y la infiltración inmune. Además, ratones con tumores de orthotopic fueron castrados quirúrgicamente, conduce a la regresión del tumor inmediata y posterior recurrencia, que representa el cáncer de próstata resistente a castración. Aunque la habilidad técnica es necesaria para llevar a cabo este procedimiento, este modelo de syngeneic ortotópico de cáncer de próstata andrógeno-dependiente y resistente a la castración es de gran utilidad para todos los investigadores en el campo.
El cáncer de próstata se estima que la incidencia más alta (161.360 hombres) y causar las muertes de cáncer masculino más tercera (84.590 hombres) en 20171. Tras el diagnóstico, tumores de próstata son andrógeno dependientes y son tratados por cirugía prostatectomía, radioterapia o terapia de privación androgénica (ADT), sin embargo, cada tratamiento se asocia con múltiples principales morbilidades y complicaciones2 , 3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10. a pesar de la regresión del tumor después de ADT, se repiten casi todos los tumores como el cáncer de próstata resistente a castración (CPRP). En esta etapa, tratamientos aprobados incluyen docetaxel, inmunoterapia Sipuleucel-T y el antiandrógeno pequeñas moléculas enzalutamide y abiraterona, sin embargo, no hay terapia individual confiere un beneficio de supervivencia de más de 5,2 meses11, 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17. por lo tanto, los hombres en todas las etapas del cáncer de próstata necesitan opciones de mejora del tratamiento y manejo de enfermedades, para que la enfermedad preclínica óptima modelado es crucial.
Con el procedimiento correcto, las líneas celulares de cáncer de próstata pueden ser inculcadas quirúrgicamente dentro de la próstata murina, llevando al desarrollo de ambos tumores ortotópicos syngeneic o xenogeneicos. Modelado de tumor de orthotopic es ideal para todos tumor biología y drogas desarrollo investigación, lo que permite un desarrollo de tumores con un microambiente tumoral clínicamente representativos (TME). Estudios anteriores han demostrado que los tumores subcutáneos (s.c.) tienen una vasculatura tumoral alterado, llevando a diferencial y menos clínico precisas respuestas a anti-angiogenic terapias18,19. Además, varios estudios han observado la eficacia de aumento o disminución de varios quimioterápicos en el tratamiento de la misma línea celular, dependiendo de si es administrado s.c. o orthotopically, que representa mejor lo que se ve en humanos cáncer20,21,22. Además, sólo en un modelo ortotópico de cáncer de colon, pero no en el modelo de s.c., tumores producen las enzimas degradativas correcto necesarias para inducir la metástasis23. Por último, las inmunoterapias siguen apareciendo en la vanguardia de la terapia del cáncer, y especialmente deben proporcionar un beneficio significativo para el cáncer de próstata24,25, syngeneic modelos preclínicos con TME precisa y drenaje linfáticos en anfitriones inmunocompetentes son críticos.
Hay muchos factores responsables de estos resultados inconsistentes en el sitio del tumor. Con un TME diferentes, las células cancerosas están expuestas a diferentes tejidos específicos endotelio y alteración la angiogénesis, afectando tumor desarrollo26,27. Tumores ortotópicos con TME correcto permiten el suministro de medicamentos clínicamente relevantes, condiciones hipóxicas y evaluación de anti-angiogenic terapias28. Mientras que modelos genéticamente (GEMs) contienen un TME precisa, que requieren mucho tiempo épocas de cría, alto costo y son a menudo basan en manipulaciones de uno o pocos genes noqueado o sobre expresa más allá de niveles clínicamente relevantes. En contraste, las líneas celulares de cáncer de próstata humano y murino utilizadas en tumores ortotópicos, como los tumores humanos, son genéticamente más complejas dentro de las células y en Mostrar heterogeneidad entre células29,30. También a diferencia de gemas, ortotópico líneas celulares de cáncer pueden ser diseñadas para expresar modalidades de imágenes o aumentadas o disminución de los niveles de otras moléculas de interés y in vitro e in vivo los resultados experimentales puede compararse directamente. Ortotópica de tumores también pueden ser formados de células derivadas del paciente primarias. Aquí, divulgamos la metodología para la realización de inyecciones intra prostática de las células de cáncer de próstata que forman tumores andrógeno-dependientes de orthotopic y, después de la castración, se repiten como orthotopic del CPRP.
En este manuscrito Contorneamos el protocolo para realizar inyecciones de células de cáncer prostático intra quirúrgica. Utilizamos el andrógeno-dependiente y MYC –overexpressing (MYC sobreexpresión es vista a 80-90% de cáncer de próstata humano39) línea de celular del murino de cáncer de próstata, Myc-CaP, aislado originalmente de la Hi-Myc ratón32 ,33. Esta línea celular fue transduced estable para expresan luciferasa y mCherry, no invasivo en vivo imagen de tumor bioluminiscente y fluorescente, respectivamente. También se realizó la castración quirúrgica, más después del desarrollo de tumor dependiente de andrógenos, conduce a la regresión del tumor y la recurrencia posterior. Por ello, ofrecemos información para el cáncer de próstata andrógeno-dependiente ortotópico y CPRP en un anfitrión inmunocompetente.
MYC-CaP las células se inyectan en el lóbulo anterior de la próstata de ratones. La próstata del ratón consiste en los lóbulos anteriores, ventrales y dorsolateral de próstata y la próstata humana consiste en una zona periférica, zona transicional y zona central dentro de un solo lóbulo40. Mientras que estudios anteriores han comparado anatómico e histológico del lóbulo dorsolateral del ratón al humano periférico de la zona, el sitio de la mayoría de los cánceres de próstata41y el lóbulo anterior del ratón a la zona central humano42, 43, más reciente y amplio análisis ha demostrado que el lóbulo anterior y lóbulo dorsolateral muestran patrones de expresión de genes estrechamente relacionados, en comparación con el lóbulo ventral. 44 además, desarrollo de cáncer de próstata se ha observado en el lóbulo anterior de gemas40y, para el procedimiento intra prostática, lóbulo anterior permite la inyección del volumen necesario de solución de la célula de cáncer con fuga mínima y variabilidad.
Utilizando s.c. y Gema transgénica modelos de cáncer tienen varios defectos y limitaciones. S.c. los tumores en un TME artificial tienen respuestas diferenciales a las quimioterapias, en contraste con ambos tumores ortotópicos de la misma línea celular y enfermedad humana20,21,22. Esto puede ser debido a la vasculatura alterada de tumores s.c., como ejemplificado por su diferencial respuesta a anti-angiogenic terapia18,19. Por el contrario, los tumores orthotopic desarrollan un TME adecuado drenaje de los ganglios linfáticos y vasculatura y pueden realizarse con líneas celulares murinas, de tal modo también permitiendo análisis de Inmunología tumoral y respuesta a las inmunoterapias.
Gemas de transgénicos desarrollan tumores con un TME apropiado en un anfitrión inmunocompetente, sin embargo, estos modelos normalmente oversimplify cáncer humano mediante el desarrollo de tumores con alteraciones genéticas solo o pocos29. Un análisis de Myc-CaP y otras líneas celulares de cáncer de próstata reveló que contenían mucho mayor alteraciones de número de copia somáticas y alteraciones cromosómicas que los tumores de los ratones Hi-Myc y otras gemas que eran derivados29. Además, gemas están limitadas por el aumento de los costos y el tiempo necesario para los ratones de cría para realizar experimentos de suficiente potencia. Modelado de orthotopic tumor puede superar estas limitaciones. Líneas celulares de cáncer de próstata humano y murino contienen muchas alteraciones genéticas relevantes para la enfermedad humana29y, como cáncer en humanos, también muestran gran heterogeneidad entre las células individuales30. Tumores syngeneic murinos ortotópico permiten análisis inmunológicos, mientras orthotopic tumores xenogeneicos humanos permiten análisis de la terapéutica de células humanas. Finalmente, a diferencia de con gemas, célula líneas pueden ser modificadas antes de la inyección, lo que permite expresión de bioluminiscente o fluorescente de moléculas para controlar el crecimiento del tumor, normaliza la carga del tumor entre los grupos experimentales, vigilar la respuesta al tratamiento y a Siga la regresión del tumor y la recurrencia de CPRP después de la castración quirúrgica.
Pasos críticos en este protocolo incluyen localización y externalizar la vesícula seminal y el adjunto anterior lóbulo prostático sin dañar otros tejidos o punción de la vesícula seminal, realizar un acertado inyección intra prostática de 30 μl de células suspensión sin salida y recogida adecuadamente cualquier fuga para prevenir el desarrollo de tumor no orthotopic en todo el abdomen. La limitación principal de inyecciones intra prostática es lograr la habilidad técnica necesaria para minimizar la variabilidad de tumor entre ratones. Esto es especialmente importante para el modelado de CPRP, que tiene la variable agregada de la castración quirúrgica. Ratones intra-prostatically inyectados y castrados deben también ser seguidos de cerca para la recuperación y los eventos adversos, como han sometido a dos cirugías de mayor supervivencia. Otra limitación es el tiempo de cada inyección intra prostática. Esto se puede reducir a como bajo como 20 min y el cirujano asistente puede preparar el siguiente ratón como el ratón actual está siendo suturado. Por último, los tumores orthotopic Myc-CaP son agresivos, rápido crecimiento tumores que alcanzan el extremo de supervivencia en aproximadamente 46 días (y ya en 35 días) debido al tumor primario total. Estudios que requieren de más lento desarrollo del tumor o tratamientos a largo plazo deben optimizarse empíricamente para el régimen de cuenta y tratamiento de células de inyección inicial. En contraste con las limitaciones de tumores s.c. y joyas, todos de las limitaciones del modelo ortotópico tumor pueden superar, y pueden hacer modificaciones adicionales del protocolo basados en necesidades experimentales.
Como el trasplante orthotopic del modelo de tumor implica el uso de vitro-mango, estas células pueden ser modificadas dependiendo de las necesidades del estudio. Aquí, modificamos estas células para estable expresan luciferasa y mCherry en vivo seguimiento tumoral. También hemos realizado un nocaut en el Cas9 CRISPR del supresor del tumor PTEN, para generar una línea más agresiva, clínicamente relevante de la célula que crece más rápido como tumores ortotópicos (manuscrito en revisión). Con las ventajas del modelo ortotópico de tumor, la capacidad para el estudio de cáncer de próstata andrógeno-dependiente y CPRP tanto el potencial de expresar modalidades de imágenes o caída o sobrexpresan genes selectos, este protocolo sirve como un valioso recurso para todos investigación de cáncer de próstata.
The authors have nothing to disclose.
Este trabajo fue financiado por los institutos nacionales de subvenciones de salud Praveen Thumbikat (NIDDK R01 DK094898), Abdulkadir Sarki (NCI R01 CA167966, NCI R01 CA123484, NCI P50 CA180995) y Jonathan Anker (NCI F30 CA203472).
Myc-CaP cell line | ATCC | CRL-3255 | Verify as mycoplasma-free before use |
Micro-dissecting scissors | Roboz | RS-5910 | |
Graege forceps | Roboz | RS-5135 | |
Graefe tissue forceps | Roboz | RS-5150 | |
Olsen-Hegar needle holder with suture cutters | FST | 12002-12 | |
50 µL Syringe 705 RN SYR | Hamilton | 7637-01 | Sterilize by ethylene oxide gas |
28-gauge Needles Small Hub RN | Hamilton | 7803-02 | Point style 4, Angle 45°, Length 0.75 in. Sterilized by ethylene oxide gas |
RPMI | Gibco | 18875-093 | |
FBS | Gibco | 10437-028 | |
Pencillin/Streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
PBS | Gibco | 14190-144 | |
0.25% trypsin-EDTA | Gibco | 25200-056 | |
Matrigel basement membrane matrix, phenol red-free, LDEV-free | Corning | 356237 | Thaw on ice in 4°C overnight before use |
Isoflurane | Henry Schein | 11695-0500-2 | Acquired from Northwestern University Center for Comparative Medicine (CCM) |
26 5/8-gauge syringe | BD | 309597 | For meloxicam and buprenorphine injections |
Buprenorphine hyrochloride 0.3 mg/mL | 12496-0757-5 | Controlled substance, acquired from Northwestern University CCM | |
Ophthalmic ointment lubrication | Akron | 17478-162-35 | |
Betadine surgical scrub (povidone-iodine, 7.5%) | Purdue Products | 67618-151-16 | |
Sterile non-adhering pads | Moore Medical | 10775 | |
Sterile alcohol wipes | Fisher Scientific | 22-363-750 | |
Surgical microscope Stemi DV4 | Zeiss | ||
Sterile polyester tipped applicators | Puritan | 25-806 1PD | |
5-0 vicryl absorbable reverse cutting needle sutures | eSutures | J493G | |
4-0 nylon monfilament non-absorbable reverse cutting needle sutures | eSutures | 699H | |
Glass bead sterilizer | Fine Science Tools | 18000-45 | |
Sterile saline 0.9% sodium chloride | Hospira | 0409-4888-02 | |
Meloxicam (Eloxiject) 5 mg/mL | Henry Schein | 11695-6925-1 | Acquired from Northwestern University CCM |
D-luciferin Firefly, sodium salt monohydrate | Goldbio | LUCNA | |
IVIS Spectrum Imaging System | PerkinElmer | ||
Cauery surgical pen | Bovie Medical Corporation | AA01 | |
CD3ε antibody (clone 2GV6) | Ventana | 790-4341 | |
Caliper | Fisher Scientific | 14-648-17 | |
Androgen receptor antibody | Thermo Scientific | RB-9030-P1 | 1:500 staining dilution |
Synaptophysin antibody (clone Z66) | Life Technologies | 18-0130 | 1:200 staining dilution |