이 프로토콜의 목표 후속 거세와 전립선 암 세포의 내부 전립선 주사를 설명 하는 것입니다. 안 드로 겐 의존 및 거세 저항 전립선 암의 Orthotopic 전 임상 모델은 임상 관련 종양 microenvironment 및 immunocompetent 호스트의 컨텍스트에서 질병 연구에 중요 한.
여러 이점이 둘 다 피하는 하 고 유전자 변형 유전자 조작 마우스 모델 Orthotopic 종양 모델링은 전 임상 전립선 암 연구를 위한 유용한 도구입니다. 피하 종양, 달리 orthotopic 종양 임상 더 정확한 맥 관 구조, 종양 microenvironment, 및 여러 치료에 대 한 응답을 포함. 반면 유전자 조작된 마우스 모델, orthotopic 모델 저렴 한 비용으로 수행할 수 있습니다 및 더 적은 시간에서 매우 복잡 하 고 유형이 다른 마우스 또는 인간 암 세포 선의 사용을 포함 오히려 그 단일 유전 변경, 그리고이 셀 라인 수정할 수 있습니다 유전자, 표현 이미징 에이전트와 같은. 여기, 선물이 수술 쥐의 앞쪽 전립선 엽 luciferase mCherry 표현 murine 전립선 암 세포 라인을 주입 하는 프로토콜. 이러한 마우스 개발 orthotopic 종양을 비 접촉 모니터링 vivo에서 더욱더 종양 양, 무게, 마우스 생존, 및 면역 침투에 대 한 분석. 또한, orthotopic 종양 방위 쥐 했다 수술 거세, 즉시 종양 회귀 및 연속적인 재발, 대표 하는 거세 내성 전립선 암. 기술이이 절차를 수행 하는 데 필요한, 하지만이 syngeneic orthotopic 모델 모두 안 드로 겐 의존 및 거세 저항 전립선 암 분야에서 모든 조사를 위대한 사용입니다.
전립선 암은 높은 발생률 (161,360 남자) 하 고 20171(84,590 남자) 제 3 대부분 남성 암 사망 원인으로 추정 된다. 진단 되 면, 전립선 종양 androgen 종속 되며 전립선 수술, 방사선 요법, 그리고 androgen 부족 요법은 (대서양 서머 타임)에 의해 처리 됩니다 아직 각 치료 관련 여러 주요 morbidities 및 합병증2 , 3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10. 종양 회귀 ADT 후,에 불구 하 고 거의 모든 종양 재발 거세 내성 전립선 암 (CRPC). 이 단계에서 승인 된 치료 포함 docetaxel, Sipuleucel-T immunotherapy, 안티 androgen 작은 분자 enzalutamide 및 abiraterone, 아직 아무 개별 치료 5.2 개월11, 보다는 더 많은 것의 생존 혜택 수 여 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17. 전립선 암의 모든 단계에서 남자 향상 된 치료 옵션 및 morbidities, 어떤 최적의 전 임상 질병에 대 한 모델링은 중요 한 관리를 필요로 하는 따라서.
올바른 절차와 전립선 암 세포 라인 수술 두 syngeneic 또는 xenogeneic orthotopic 종양의 개발으로 이어지는 murine 전립선으로 얻은 될 수 있다. Orthotopic 종양 모델링은 모든 종양 생물학 및 약물 개발 연구, 임상 대표적인 종양 microenvironment (TME)와 종양 개발에 대 한 허용 합니다. 이전 연구는 피하 (사우스 캐롤라이나) 종양은 변경 된 종양 맥 관 구조, 안티-신생 요법18,19차동 및 더 적은 임상 정확한 응답에 지도 증명 하고있다. 또한, 여러 연구 관찰 치료 여부에 따라 동일한 셀 라인에 여러 chemotherapeutics의 증가 또는 감소 효능 관리 사우스 캐롤라이나 또는 orthotopically, 후자는 최고의 인간에서 본 것 표현 암20,,2122. 또한, 대 장 암의 orthotopic 모델에만 하지만 사우스 캐롤라이나 모델에 종양 생성 않았습니다 전이23을 유도 하는 데 필요한 올바른 degradative 효소. 마지막으로, immunotherapies 계속 암 치료의 최전선에 등장 하 고 특히 그들은 아직 전립선 암24,25, 정확한 TME syngeneic 전 임상 모델에 대 한 상당한 혜택을 제공 하 고 immunocompetent 호스트 드레이닝 림프절은 중요 합니다.
종양 사이트에 따라 이러한 일관성 없는 결과 대 한 책임 여러 가지 요인 있다. 다른 TME 암 세포 다른 조직 관련 endothelium에 노출 되 고 신생, 종양 개발26,27에 따라서 영향을 미치는 변경. 올바른 TME Orthotopic 종양 임상 관련 약물 전달, hypoxic 조건, 및 안티-신생 치료28의 평가 대 한 수 있습니다. 종종 번 식, 높은 비용, 고 대 한 번 기 절 또는 임상 관련 수준을 넘어 overexpressed 단일 또는 몇 가지 유전자의 조작에 따라 유전자 조작된 모델 (보석) 그들은 오랫동안 필요로 하는 정확한 TME 포함 할. 반면, 인간 또는 murine 전립선 암 세포 선 인간의 종양 같은 orthotopic 종양에 사용 되는 단일 세포 내와 세포29,30사이 성분 표시에 훨씬 더 많은 유전자 복잡 합니다. 또한 보석, 달리 orthotopic 암 세포 라인 이미징 modalities를 표현 하기 위해 설계 되었습니다 하거나 수 증가 또는 관심, 그리고 생체 외에서 그리고 vivo에서 실험 결과의 다른 분자의 감소 수준을 직접 비교할 수 있습니다. Orthotopic 종양 또한 기본 환자 파생 된 세포에서 형성 수 있습니다. 여기, 우리 보고 orthotopic androgen 종속 종양을 형성 하 고, 거세, 후 orthotopic CRPC로 재발 하는 전립선 암 세포의 내부 전립선 주사를 수행 하기 위한 방법론.
이 원고에서 우리 외과 내 전립선 암 세포 주사를 수행 하기 위해 프로토콜을 설명 합니다. 우리는 안 드로 겐 의존 및 MYC-overexpressing 활용 (MYC overexpression 볼까지 인간 전립선 암39의 80-90%) murine 전립선 암 세포 선, Myc-모자, 원래이 Myc 마우스32 에서에서 격리 33. 이 셀 라인 luciferase와 발광 및 형광 종양 영상 비-침략 적 비보에 대 한 mCherry를 각각 표현 하 불리고 안정적 이었다. 더, 외과 거세 또한 androgen 종속 종양 개발, 종양 회귀 및 연속적인 재발 후 수행 되었다. 따라서, 우리는 세부 모델 orthotopic androgen 종속 전립선 암 및 CRPC immunocompetent 호스트에 제공 합니다.
Myc 캡 셀 쥐의 앞쪽 전립선 엽에 주입 했다. 마우스 전립선 앞쪽, 복 부, 그리고 dorsolateral 전립선 엽의 구성 되어 있으며 인간의 전립선 주변 영역, 과도 영역 및 단일 엽40내의 중앙 영역 구성 됩니다. 이전 연구는 해부학과 조직학 비교 인간의 주변에 dorsolateral 마우스 엽 동안 구역, 전립선 암41의 대부분과 이전 마우스 엽 인간의 중앙 영역42, 의 사이트 43, 더 최근과 포괄적인 분석 앞쪽 엽과 dorsolateral 엽 복 부 엽에 비해 밀접 하 게 관련된 유전자 표현 패턴 표시를 보여주었다. 44 추가, 전립선 암 개발 보석40, 앞쪽 엽에서 관찰 되었습니다. 그리고 내 전립선 절차에 대 한 최소한의 누설 암 세포 솔루션의 필요한 볼륨의 주입을 위해 앞쪽 엽 수 그리고 다양성입니다.
사우스 캐롤라이나 및 유전자 변형 보석을 사용 하 여 암 모델은 여러 개의 결함 및 제한. 인공 TME에서 성장 하는 사우스 캐롤라이나 종양 같은 셀 라인 및 인간 질병20,,2122에서 두 orthotopic 종양 달리 chemotherapies 차동 응답 있다. 이 안티-신생 치료18,19차동 반응에 의해 exemplified로 사우스 캐롤라이나 종양의 변경된 맥 관 구조 때문일 수 있습니다. 그와 반대로, orthotopic 종양 적절 한 TME, 배출 림프절 및 맥 관 구조, 개발 하 고 murine 셀 라인, 그로 인하여 또한 종양 면역학 및 immunotherapies에 대 한 응답의 분석에 대 한 수 있도록 수행할 수 있습니다.
유전자 변형까지 개발 된 immunocompetent 호스트에 적절 한 TME 종양 아직 이러한 모델은 일반적으로 단일 또는 몇 가지 유전 변경29와 종양을 개발 하 여 인간의 암을 지나치게 단순화. Myc 모자 및 다른 전립선 암 세포 라인의 분석은 그들은 훨씬 더 큰 체세포 복사 번호 변경 및 종양이 Myc 마우스 및 어떤에서 그들이 파생된29다른 보석 보다 염색체 변경 포함 된 밝혔다. 또한, 보석 쥐 충분 한 전력의 실험을 수행 하기 위해 번 식에 필요한 시간과 비용 증가 의해 제한 됩니다. Orthotopic 종양 모델링은 이러한 한계를 극복할 수 있다. 인간과 murine 전립선 암 세포 선 인간의 질병29, 관련이 많은 유전 변경 포함 하 고, 인간의 암 처럼 표시 또한 개별 셀30사이 좋은. Orthotopic murine syngeneic 종양 면역 분석에 대 한 허용 orthotopic 하면서 인간의 xenogeneic 종양 허용 인간 세포에 치료제의 분석. 마지막으로,와 달리 보석, 셀 라인 주입, 종양 성장, 모니터 발광 또는 형광 분자 이미징의 표현에 대 한 수 있도록 표준화 실험 그룹 간의 종양 부담 하기 전에 수정할 수 있습니다 모니터링, 처리 하 고 응답 따라 종양 회귀와 외과 거세 후 CRPC 되풀이 합니다.
이 프로토콜의 중요 한 단계를 찾는 등 다른 조직 손상 또는 세포의 30 µ L의 성공적인 내부 전립선 주사를 수행 정액 소포를 puncturing 없이 정액 소포와 연결 된 앞쪽 전립선 엽을 외부화 누설, 그리고 복 부에 걸쳐 비 orthotopic 종양의 개발을 방지 하기 위해 어떤 누설을 제대로 수집 하지 않고 현 탁 액. 내 전립선 주사의 주요 한계 쥐 사이 종양 변화를 최소화 하는 데 필요한 기술을 달성 이다. 이 외과 거세의 추가 변수가 CRPC 모델링에 대 한 특히 중요 하다. 내 prostatically 주입 하 고 거세 쥐 해야 합니다 또한 따라야 밀접 하 게 복구 및 불리 한 이벤트에 대 한 그들은 두 개의 주요 생존 수술 받은 대로. 또 다른 한계는 각 내부 전립선 주입의 시간 이다. 이 감소 될 수 있다을 최저 20 분, 그리고 외과 의사 조 수 준비 다음 마우스 현재 마우스 봉합 되 고. 마지막으로, orthotopic Myc 모자 종양 공격적, 빨리 성장 하 고는 생존 끝점 약 46 일에서 (35 일) 기본 종양 때문에 도달 하는 종양 질량입니다. 느린 종양 개발 또는 장기 치료를 필요로 하는 연구 초기 주입 세포 수 및 치료 처방에 대 한 경험적으로 최적화 되어야 합니다. 사우스 캐롤라이나 종양 및 보석의 한계, 달리 모든 orthotopic 종양 모델의 위의 한계 극복 될 수 있다, 그리고 프로토콜의 추가 수정 개별 실험 요구 사항에 따라 만들 수 있습니다.
orthotopic로 종양 모델 생체 외에서의 사용을 포함-처리 셀,이 연구의 필요에 따라 수정할 수 있습니다. 여기, 우리는 안정적으로 luciferase vivo에서 종양 모니터링을 위한 mCherry을 표현 하는이 세포 수정. 우리는 또한 종양 억제기 PTEN, orthotopic 종양 (원고 검토에서)로 빠르게 성장 하는 공격적인, 임상 관련 셀 라인을 생성 하는 CRISPR Cas9 녹아웃을 수행 했습니다. Orthotopic 종양 모델, androgen 종속 전립선 암 CRPC, 및 이미징 형식 또는 최저 또는 overexpress 선택 유전자 표현을 공부 하는 능력의 장점으로이 프로토콜 모두를 위한 귀중 한 자원으로 역 전립선 암 연구입니다.
The authors have nothing to disclose.
이 작품은 Praveen Thumbikat (NIDDK R01 DK094898), Sarki Abdulkadir (NCI R01 CA167966, NCI R01 CA123484, NCI P50 CA180995), 그리고 조나단 Anker (NCI F30 CA203472) 건강의 국가 학회에 의해 지원 되었다.
Myc-CaP cell line | ATCC | CRL-3255 | Verify as mycoplasma-free before use |
Micro-dissecting scissors | Roboz | RS-5910 | |
Graege forceps | Roboz | RS-5135 | |
Graefe tissue forceps | Roboz | RS-5150 | |
Olsen-Hegar needle holder with suture cutters | FST | 12002-12 | |
50 µL Syringe 705 RN SYR | Hamilton | 7637-01 | Sterilize by ethylene oxide gas |
28-gauge Needles Small Hub RN | Hamilton | 7803-02 | Point style 4, Angle 45°, Length 0.75 in. Sterilized by ethylene oxide gas |
RPMI | Gibco | 18875-093 | |
FBS | Gibco | 10437-028 | |
Pencillin/Streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
PBS | Gibco | 14190-144 | |
0.25% trypsin-EDTA | Gibco | 25200-056 | |
Matrigel basement membrane matrix, phenol red-free, LDEV-free | Corning | 356237 | Thaw on ice in 4°C overnight before use |
Isoflurane | Henry Schein | 11695-0500-2 | Acquired from Northwestern University Center for Comparative Medicine (CCM) |
26 5/8-gauge syringe | BD | 309597 | For meloxicam and buprenorphine injections |
Buprenorphine hyrochloride 0.3 mg/mL | 12496-0757-5 | Controlled substance, acquired from Northwestern University CCM | |
Ophthalmic ointment lubrication | Akron | 17478-162-35 | |
Betadine surgical scrub (povidone-iodine, 7.5%) | Purdue Products | 67618-151-16 | |
Sterile non-adhering pads | Moore Medical | 10775 | |
Sterile alcohol wipes | Fisher Scientific | 22-363-750 | |
Surgical microscope Stemi DV4 | Zeiss | ||
Sterile polyester tipped applicators | Puritan | 25-806 1PD | |
5-0 vicryl absorbable reverse cutting needle sutures | eSutures | J493G | |
4-0 nylon monfilament non-absorbable reverse cutting needle sutures | eSutures | 699H | |
Glass bead sterilizer | Fine Science Tools | 18000-45 | |
Sterile saline 0.9% sodium chloride | Hospira | 0409-4888-02 | |
Meloxicam (Eloxiject) 5 mg/mL | Henry Schein | 11695-6925-1 | Acquired from Northwestern University CCM |
D-luciferin Firefly, sodium salt monohydrate | Goldbio | LUCNA | |
IVIS Spectrum Imaging System | PerkinElmer | ||
Cauery surgical pen | Bovie Medical Corporation | AA01 | |
CD3ε antibody (clone 2GV6) | Ventana | 790-4341 | |
Caliper | Fisher Scientific | 14-648-17 | |
Androgen receptor antibody | Thermo Scientific | RB-9030-P1 | 1:500 staining dilution |
Synaptophysin antibody (clone Z66) | Life Technologies | 18-0130 | 1:200 staining dilution |