オプトジェネティクスを組み合わせてそのまま神経回路内でのシナプス前機能に関する遺伝子ノックダウンの効果を特徴付ける人工マイクロ Rna

すべての実験コミュニティ欧州 (ディレクティブ 2010年/63/2014 年 3 月 4 日の)、EU 理事会によって確立されたガイドラインに従って実施された、イタリアの保健省によって承認されました。 1 RNA 干渉と異種発現システムの効率性評価のためのマイクロ Rna のデザイン 注: このプロトコル確立以下の知識が必要です: 分子クローニング、DNA 塩基配列、細胞株、リン酸カルシウム トランスフェクション ・量的な実質のメンテナンス時間 PCR (qRT PCR)、細胞からのセル lysates の準備西部にしみが付くこと. 興味の遺伝子が選択的スプライシングを受けるかどうかを決定します。遺伝子の一般的なノックダウン、専ら構成エクソン; を選択します。特定の交互スプライシング アイソ フォームのノックダウン、関連する交互スプライシング エクソンを選択します。 専用ソフトウェア (例えばhttps://rnaidesigner.thermofisher.com/rnaiexpress/) を使用すると、興味のシーケンスに対する RNA 干渉のため人工 miRs をデザインします。注: 同じ種の内で可能なオフ目標を確認する基本的なローカル配置検索ツール (爆発) を使用することが重要です。 目的遺伝子のトップ 3 位 miRs を選択します。 適した会社から選択した miRs の上部と下部の鎖を注文します。ネガティブ コントロール用スクランブル バージョンのいずれか選択した miRs または、ミール予測実験で使用される種のすべての知られていた遺伝子をターゲット (e.g。 脊椎動物の遺伝子、ミール pcDNA6.2 GW/EmGFP ミール neg に存在)。 選択した miRs のそれぞれの上部と下部のストランドをアニールし、miRs (例えばpcDNA6.2 ・ GW/EmGFP-ミール) 標準的なクローン作成戦略を使用しての表現のために設計されたプラスミドにそれらをクローンします。注: 目的並ぶ領域を使用して、5′ ミール、選択したミール シーケンスおよび 3′ ミール並ぶ領域から 3′ UTR RNA ポリメラーゼ タイプ II のプロモーターの制御下でレポーターの遺伝子の表現できるから成る miR 式カセットを作成することです。 DNA の配列を使用して、選択した miRs の正しい挿入を検証します。 (37 ° C、5% CO2) 加湿細胞文化のインキュベーターで HEK293 細胞を成長 DMEM を使用培地添加 10% 牛胎児血清 1 mM NaPyruvate 10 mM HEPES (pH 739万) と 1 x ペニシリン/ストレプトマイシン (ペン/連鎖球菌)。 HEK293 細胞は ~ 70% 合流、ミールの表現のベクトルの DNA の 1:1 比率リン酸カルシウム法6を使用する目標とされた遺伝子を表現するベクトルそれぞれに transfect それら共同。次のコントロールが含まれます: (i) 融合細胞、DNA (例えばpBluescript II SK(+)) または (iii) ミール コントロール会社のいずれかと一緒に目標とされた遺伝子を表現するベクトルをトランスフェクトした細胞 (ii)。注: (i) ターゲット遺伝子発現、miRs の設計方向の同じ種からなければなりません、miRs で対象とするシーケンスが確実に 2 種間の塩基配列レベルで保存されています。(ii) 細胞 HEK293 以外は使用できます。(iii) 遺伝子導入、エレクトロポレーションやリポソーム法などの方法を使用できます。 トランスフェクション後、48 h、細胞を溶解、タンパク質のゲルをラン、西部のしみを実行、タンパク質標的タンパク質を認識する抗体とコンテンツを分析します。ノックダウン効率: 50% を目指してください。メモ: ノックダウン効率または、することができます、さらに、(i) elisa 法による、(ii) 該当する場合、ターゲット蛋白質の活性を測定することによって評価される (例えばイオン チャンネル電流密度) または (iii) 適切な場合の mRNA レベルでの qRT PCR抗体が利用できない (プロトコル手順 3)。 氷の上の培養皿を置き、冷たいリン酸緩衝生理食塩水 (PBS) で一度セルを洗浄します。 氷冷 RIPA バッファー (50 mM トリス塩酸 pH 7.4 では、150 mM の NaCl、2 ミリメートルの EDTA、1 %np40、0.1% ドデシル硫酸ナトリウム (SDS) ホスファターゼとプロテアーゼ阻害剤を含む; Ø 100 mm、Ø 60 mm ディッシュ用 0.5 mL の皿のための 1 mL) を追加し、PBS を吸引します。 付着性のセルをこすり細胞スクレーパーを使用して皿と優しく予冷遠心チューブに細胞懸濁液を移します。 4 ° C で 15 分間 15,000 × g でチューブを遠心分離機、新しい事前冷却遠心チューブに上清を転送し、ペレットを破棄します。 BCA タンパク質アッセイ キットやその他の適切な方法 (例:ブラッドフォードの試金) を用いたタンパク質濃度を決定します。注: サンプルが-20 ° C または後で使用するため-80 ° C で凍結したり、すぐに処理します。 カードをマイクロ遠心チューブ用に転送、溶解液の適切なボリュームをすべてサンプル蛋白質濃度が同じ、同じボリュームにすべての lysates を作るに十分な冷たい換散バッファーを追加します。注: 全蛋白質の 30 に 50 μ g は蛋白質のほとんどのために十分にする必要がありますが、ロードする適切な量興味の蛋白質の豊かさに応じて決定してください。 2 x Laemmli バッファーの適切な量を追加 (4 %sds、10 %2-メルカプトエタノール、20% グリセロール、0.004% ブロモフェノール ブルー、0.125 M トリス-HCl、pH 6.8) と 95 ° C、5 分でサンプルを沸騰します。 分子量マーカーと一緒にアクリルアミドのゲルのサンプルを読み込みます。100 V に 1-2 時間でゲルを実行します。注: ゲルの割合は、興味の蛋白質のサイズによって異なります。 転送サンドイッチを組み立てるし、100 V 2 の h の膜にゲルからタンパク質を転送します。硝酸セルロースまたは PVDF 膜ができます。1 分のメタノール PVDF をアクティブにし、転送バッファーとスタックを準備する前に洗い流してください。 ブロック ブロック バッファーを利用して常温で 1 h の膜 (pbst; 5% ミルク (PBS + 0.1% Tween 20))、ブロック バッファーで希釈した一次抗体と 4 ° C で一晩膜を孵化します。 3 回 PBST で 10 分間膜を洗浄し、室温で 1 時間ブロッキング バッファーに HRP 標識二次抗体とインキュベートします。 PBS で 10 分間膜を洗浄する 4 回し、化学発光基質を膜に適用し、CCD カメラを用いた撮像を用いた化学発光信号をキャプチャします。 ノックダウン効率を定量化するのに画像解析ソフトを使用します。 2 つの最も効率的な miRs ターゲットにさらに機能試金のための非重複のシーケンスを選択します。注: ターゲットを離れて効果決して完全排除できる任意のミールの。ただし、2 つの独立した miRs ある同様の効果は、非常に考えにくい同じターゲットをノックダウンのためであります。 選択した miRs のノックダウン効率が不十分かどうか (< 50%)、その他 miRs の画面。また、エクスプレスでタンデム、つまり最も効率的な miR(s) でそれらを表現ノックダウン効率7可能性があります同じ式カセットから複数のコピー。 2. 光の式プローブを組み合わせるとマイクロ Rna の遺伝子組換えアデノ随伴ベクトルの建設 注: このプロトコル確立以下の知識が必要です: 分子クローニング、DNA シーケンシングおよび下さい rAAV 生産。 3′ UTR 組換え rAAVs の生産と興奮性の光の表現のために設計された構造の最も効率的なミール式カセットの各クローン ・ プローブ、pAAV-Syn-ChETA-TdT-miR-X (図 1 a) のような場所、神経特異 synapsin プロモーター駆動式超高速チャネルロドプシン ケータの赤い蛍光レポーター、TdTomato、miR(s) NheI、EcoRI サイト5の間に挿入します。注: (i) まらない、rAAVs の包装制限 (図 1 a, オレンジ) ITR ITR (倒立ターミナル繰り返し) からの長さで約 4.7 Kb であります。(ii) miR 式カセットは停止コドンと WPRE (ウッド チャック肝炎のウイルスの転写で規制要素の間に挿入する必要があります。図 1 a)。(iii) TdTomato などの蛍光タンパク質を含めることはローカリゼーションと感染症 (プロトコル手順 4) の強度を容易に監視できるので非常に便利。 DNA の配列を使用して、ミール カセットの正しい挿入を確認します。 農産物と力価 rAAV1/2 以前に公開されたプロトコル8によると、各選択したミールの 1 つ rAAV1/2。1 つの遺伝子のノックダウンのための 1 つの典型的な実験には、同じ遺伝子と 1 つのミール コントロールに対して 2 つの独立した miRs が含まれます。≥109ウイルス ゲノム (英領バージン諸島) のウイルス抗体価を目指して/μ L。注意: rAAVs は、バイオ セーフティ レベル 1 (BSL-1) の施設で処理する必要があります。詳細については制度バイオ セーフティ委員会にご確認ください。注: ウイルスの施設を持たない研究所ウイルス抗体価が不十分な場合や、下さい rAAV 生産を委託することができます。たとえば、https://www.med.upenn.edu/gtp/vectorcore/ または https://vcf.charite.de/en/metas/ を参照してください。 3. qRT PCR によるミール内在性遺伝子のノックダウン効率の評価のための一次神経文化からの RNA の抽出 注: (i) このプロトコル確立以下の知識が必要です: 準備および一次神経文化および qRT PCR のメンテナンス。(ii)、少なくとも 3 回のノックダウン効率 (ステップ 3.1-3.14) の定量化を繰り返します (生物レプリケートします)。(qRT PCR による mRNA レベルでノックダウン効率の推定 iii) は、アイソ フォーム、特定の抗体がない利用可能な5スプライスまたはノックダウン時など、タンパク質含有量の分析を排除するに適しています。 興味の脳の領域からの一次神経文化を準備します。以前文書9、次の変更と皮質の文化のためのプロトコルに従ってください。 ウェルあたり 500,000 ニューロンの密度で 6 ウェル プレート プレート ニューロン。2.5 mL/ウェル添付ファイル中、3.3 mL の/メンテナンス中のもを使用します。 アストロ サイトの増殖を観察すると、3-4 日の in vitro (DIV) で 0.5 mL/メンテナンス培シトシン β-D-アラビノ (最終濃度 1 μ M) のための 7.5 μ m の井戸を追加します。 5 でミール (技術的なレプリケートします) につき 3 つの井戸に感染-6 部使用最低の感染用量ニューロンの ≥99% に感染されます。 各ウェルから培地 2 mL を削除し、50 mL の隼のチューブで収集します。 ニューロンに直接ウイルスを追加、穏やかに混合し、37 ° C でインキュベーターでバック プレートを配置 インキュベーター収集媒体に格納します。ガスの平衡を許可するファルコン チューブのキャップを緩めます。 24 h 後各 (まあ 1.9 mL/) で削除されたミディアム バックを追加します。 で 17-18 部、RNA の抽出、細胞を溶解させます。注意: 溶解試薬とクロロホルムは、猛毒です。化学のフードの下で動作し、防具を着用あなたの国および教育機関のガイドラインによると廃棄物の処分します。メモ: 手順については 3.3-3.13、RNAse フリーの条件であります。手袋を着用し、RNAse フリーのガラス製品、使い捨て容器を使用します。ハンドル RNA について全般的な注意事項を参照してくださいたとえば RNeasy マイクロ ハンドブック 』 の「付録 A オンライン。 ガラス パスツール ピペット 180 ° C のオーブンで一晩インキュベートします。 プレートを傾けるし、よくパスツール ピペットを真空ポンプに接続されているガラスを使用して各から完全に培地を吸引します。 すぐに各ウェルに溶解試薬の 700 μ L を追加します。 慎重に、手で簡単にプレートを揺することを揺動によってソリューションを均等に します。 ピペット ソリューションの上下に 4 ~ 5 回または均一な懸濁液が得られるまで。 別 1.5 mL エッペン チューブに各ウェルからソリューションを転送します。注: セル lysates できます-80 ° C で保存またはすぐに処理します。 必要に応じて、セル、RT の lysates を解凍し、すぐに 3.5 の手順に進みます。 140 μ L のクロロホルムをセル lysates の各サンプルに追加します。注: クロロホルムは揮発性およびピペット、エッペン チューブをできるだけ早く終了することは困難です。 15 は積極的にエッペン チューブを振る s またはサンプルが完全に混ざるまで。 1-2 分間または液相分離し始めるまで、RT でサンプルを保管します。 遠心分離機の 4 ° C で 15 分間、12,000 × g でサンプル 新しいエッペン チューブに RNA を含む上部水性相 (~ 320 μ L) を転送し、残りの液体を破棄します。注:、下のピンクの有機相またはピペットの先端で 2 つのフェーズの間に白いリングを触れないでください。 水性相を 100% エタノール (480 μ L) の 1.5 のボリュームを追加し、ミックスに 3 回上下にゆっくりとソリューションをピペットします。 小さなサンプルからの RNA の浄化用に設計された市販のキットを使用して RNA を浄化します。 分光光度計と RNA 濃度とサンプル純度を定量化します。注: (i) 期待収量 ≥3.5 μ g/ウェル;260/280 と 260/230 比タンパク質や有機物で純度をする必要があります両方のように ≥1.9。(ii) の RNA のサンプルは-80 ° C で保存またはすぐに処理できます。 市販のキットで RNA の Retrotranscribe 250、500 または 1000 ng。 QRT PCR による興味の内因性遺伝子のノックダウン効率を定量化します。詳細なプロトコル参照10を参照してください。≥60% (図 2) のノックダウン効率を目指してください。≥2 ハウスキーピング遺伝子 (e.gデータを正規化します。GAPDH ACTB、TUBB3、PPIA)複数の内部制御遺伝子法11を使用してください。メモ: ラットでの作業、ハウスキーピング遺伝子に次の PCR プライマーを使用: GAPDH fwd: 5′ 3′ GGTGCTGAGTATGTCGTGGA と GAPDH rev: 5′ GATGATGACCCTTTTGGC 3′;ACTB fwd: 5′ 3′ CATCACTATCGGCAATGAGC と ACTB rev: 5′ TCATGGATGCCACAGGATT 3′;TUBB3-fwd: 5′ 3′ GCCTTTGGACACCTATTCAG と TUBB3 rev: 5′ TCACATTCTTTCCTCACGAC 3′;PPIA-fwd: 5 ‘ 3′ CACTGGGGAGAAAGGATTTG と PPIA rev 5’ CCATTATGGCGTGTGAAGTC 3’。 4. オプトジェネティクスをノックダウン ニューロンのターゲット刺激によってそのまま神経回路のシナプス蛋白質の役割の評価 注: 次のプロトコル急性脳スライスにおける電気生理学的セットアップへのアクセス記録と経験が必要です。 定位脳以前の文書12に詳細なプロトコルを次に rAAV1/2 を挿入します。マウス13またはラットの脳のための14の定位のアトラスを使用して興味の脳領域での定位座標を決定します。 マイクロ ピペットの引き手を使用して Ø の長いシャンク付き注入マイクロ ピペット 7-9 μ m。ハサミで、シャンクに注入マイクロ ピペットをクリップします。注入用マイクロ ピペット各 2 mm の調整マークを置く細いマーカーおよび方眼紙を使用します。 イソフルランと動物を麻酔し、定位装置でそれを修正します。 37 ° C に設定されて加熱パッドで操作中暖かい動物を保持します。 眼の潤滑剤で目を保護します。 電気カミソリで頭の毛を剃る。 綿棒を使用して坊主頭にポビドン ヨードを広めます。 解剖顕微鏡の下で正中切開を行います。 前とラムダを表示するように、綿棒と頭蓋骨表面をきれいにします。 その所有者にインジェクション ピペットを配置します。定位の腕にホルダーを取り付けます。 X と y を決定前やラムダを基準にして注射部位の座標。 ドリルを使用して、ターゲット領域に頭蓋骨を薄くします。注: は、穏やかな円形の動きを使用し、これは脳の表面を損傷、頭蓋骨をドリルを避けます。 そこは出血している場合は、タオル ペーパーで過剰な血液を吸収します。注: 血液の過剰なる z 座標が正しく決定することは困難。 インジェクション ピペットに毛管作用によってウイルスの 2 μ L を読み込みます。 X と y にインジェクション ピペットをもたらす注射部位の座標。 硬膜から z 座標を計算し、脳の中にピペットをゆっくりと下げます。 Z 座標に達したとき、組織調整できるように 3 分を待ちます。 インジェクション ピペットの背面にフレキシブル チューブを介して接続 1 mL 注射器を用いた低正圧を適用します。視覚的に解剖顕微鏡と参照点として校正記号を使用してを介してインジェクション ピペットからウイルスの排出速度を監視します。注意: ウイルスは遅い速度で注入する必要があります (< 100 nL/min) 組織の損傷を避けるために。 注入が完了したら、5 分待って、0.2 mm インジェクション ピペットを撤回、ウイルスの逆流を避けるために、別の 5 分間待ちます。 撤回するインジェクション ピペットゆっくりと完全に脳から dispose それの漂白剤を入れた容器に。 生理学的なソリューションと頭蓋骨をウェットし、3-4 針で皮膚を縫合します。 ゲンタマイシン軟膏を傷に適用されます。 シングル家食物と一緒にきれいなケージで動物のペレットし、それまでの熱ランプの下で完全に回復します。 ≥15 日は、投与後、深いイソフルラン麻酔下の動物の首をはねます。 Vibratome 使用して毒ガス (95% O2, 5% CO2) 関心の脳の領域の急性脳スライスを準備 (mM) 入っている冷たいアプライド ソリューション: 123 NaCl、1.25 KCl、1.25 KH2PO4、1.5 MgCl2, 1 CaCl2、25NaHCO3、2 NaPyruvate、18 グルコース (調整 300 mOsm 浸透圧)。たとえば、CA3 から CA1 錐体ニューロンへのシナプス伝達を分析する目的の場合は、海馬 (350 μ m 厚) の矢状のスライスを準備します。注: この手順以降から環境光による光プローブの活性化を避けるために低光の条件の下で働きます。 スライス脳スライスを保持するために設計されたチャンバー内で同じアプライドで 37 ° C で 30 分の回復をしましょう。記録まで室温で同じ脳スライス商工会議所で、スライスを維持します。注: これらの条件を使用して、スライスは 6-8 h までの健康維持できます。 転送は 1.5 ミリメートル CaCl2と補われるリカバリに使用される同じアプライドの 2 mL/min とそれを水中録音室および superfuse へスライス (Ca2 +の合計: 2.5 mM)、NaPyruvate なし。メモ: スライスに準備、Ca2 + (1 mM) の毒性を最小限に抑えるための低濃度で維持されます。録音は、2.5 mM Ca2 +小胞の放出に賛成するで実行されます。 簡潔に表現された蛍光レポーター (e.gの信号を確認します。TdTomato;図 3 b)ローカリゼーションと感染の強さを確認。 (MM) で含まれている細胞内のソリューションとパッチ電極を埋める: グルコン酸 K 110-22 KCl 塩化ナトリウム 5、0.5 グリコールエーテルジアミン四酢酸、3 MgCl2, 4 Mg ATP, 0.5 Na3GTP、20 K2-クレアチンリン酸、10 HEPES 島 (ペーハー 7.28, 290 mΩ)。注: は、ピペット抵抗値 5-6 mΩ のパッチ電極を使用します。 赤外線照明下で感染したニューロンからのシナプス入力を受けるニューロンからタイトなシール全体セル構成に到達します。たとえば、CA3 錐体細胞が感染していた場合は、CA1 領域 (図 3) の内側の管に近位の錐体細胞をパッチします。注: 直列抵抗残すことができる、非補償が定数と低 (引時間: 20 MΩ) する必要があります。 薬理学を使用して調査中シナプス電流を分離します。たとえば、興奮性シナプス伝達を調査する目的の場合は、10 μ M ビククリンにより、抑制性のシナプス伝達をブロックします。 たとえば、興奮性シナプス電流 (工) (e.g感染した神経細胞の突起に配置されている光ファイバー (Ø ≤250 μ m) と結合した 473 nm 青色レーザを用いたシナプス電流を呼び起こします。CA3 錐体細胞)。 光パルスごとの 1 つ以上の活動電位を想起させる可能性を減らすため、最小限に刺激の長さを調整します。ケータを使用している場合は、2 ms15に設定します。 小さいがはっきり検出性シナプス電流を生成するレーザーの刺激強度を調整 (工の ≤50 pA ピーク振幅記録保持性は-70 mV CA3 と CA1 錐体ニューロンの間図 3 D)。直径ケータと 250 μ m の光ファイバーを使用して、刺激繊維で 1-3 mW の強みを終了が適切なする必要があります。注: レーザー強度を規制できない場合は、中性密度フィルターを使用します。 その軸索ではなく感染した神経細胞の突起には、473 nm のレーザー光を照らします。たとえば、CA3 突起と軸索の直接脱分極を避けるために、シャファー担保から光を当てます。 テトロドトキシン (TTX; 0.5 μ M) を適用、チャネルを確認するためにサンプルのナトリウム チャネルのブロッカーは活動電位駆動。 別の録音でシナプス電流刺激が選択を確認するための調査の下に選択的なブロッカーを適用します。注: たとえば、適用 NBQX (10 μ M) に AMPA 型グルタミン酸受容体を介した工。 反復刺激 (引時間: 20 Hz で刺激 ≥2) への応答で同じ急性脳スライスの光学的および電気的誘発性シナプス電流を比較します。刺激の 2 つのタイプが同じような細胞メカニズムをアクティブことを示唆コントロール ミールを使用する場合の電気・光学的刺激間シナプス促通やうつ病の類似度を守らなければなりません。注: 上記の手順は、光の刺激により、シナプス伝達のいくつかのメカニズムをバイパス、シナプス前の研究の直接脱分極を誘発しないことを確認する必要。 シナプス伝達制御ミールと miRs 捜査シナプス蛋白質の間のシングル、反復的な刺激 (引時間: 20 Hz で刺激 ≥2) への応答と比較します。