光遗传学与人工 microRNAs 相结合对完整神经元回路中基因击倒对突触前功能的影响

所有的实验都是按照欧洲共同体理事会制定的指导方针进行的 (2014年3月4日指令 2010/63/欧盟), 并得到意大利卫生部的批准。 1. RNA 干扰 microRNAs 的设计及其在异源表达系统中的有效性评价 注意: 此协议需要了解以下已建立良好的方法: 分子克隆、DNA 测序、细胞系维持、磷酸钙转染、定量实时 pcr (qRT pcr)、细胞株裂解物细胞的制备和西方的印迹。 确定感兴趣的基因是否受替代剪接。对于基因的一般击倒, 选择专属本构外显子;对于一个特定的交替拼接异构体的击倒, 选择相关的交替拼接外显子。 使用专用软件 (例如https://rnaidesigner.thermofisher.com/rnaiexpress/) 设计人工的大鹏湾, 以实现 RNA 对兴趣序列的干扰。注意: 使用基本的本地对齐搜索工具 (爆破) 来检查同一物种内可能存在的目标是很重要的。 选择顶部三排列的目标基因的大鹏湾。 从合适的公司订购所选的大鹏湾的上下股。对于负控制, 请使用选定的大鹏湾或和平号的一个被炒版本, 预测不针对实验中使用的物种的任何已知基因 (e. g. 对于脊椎动物基因, 和平号在 pcDNA6.2-GW/EmGFP-no) 中存在。 将选定的大鹏湾的顶部和底部进行退火, 并将其克隆成质粒, 用于表达大鹏湾 (例如pcDNA6.2/EmGFP), 使用标准的克隆策略。注意: 目的是创建一个和平号表达式卡带, 由 5 ‘ 和平号的侧翼区域、选定的和平号序列和一个 3 ‘ 和平号侧翼区域组成, 可在 RNA 聚合酶 ii 型启动器控制下的一个记者基因的 3 ‘ UTR 中表达。 使用 DNA 测序验证选定的大鹏湾的正确插入。 用 DMEM 培养基在湿润细胞培养孵化器 (37 °c, 5% CO2) 中生长 HEK293 细胞, 辅以10% 胎牛血清、1毫米 NaPyruvate、10 mm HEPES (pH 7.39) 和1x 青霉素/链霉素 (笔/链球菌)。 当 HEK293 细胞为70% 的汇合时, 用磷酸钙方法6与每一个和平号表达载体和一个向量, 用1:1 的 DNA 比值表达目标基因的染。包括以下控制: (i) untransfected 细胞, (ii) 转染的载体与载体 DNA (例如pBluescript ii (+)) 或 (iii) 和平号控制相结合的向量。注: (i) 所表达的靶向基因必须来自与大鹏湾设计的同一物种, 除非大鹏靶的序列在两种核苷酸水平上绝对守恒。(二) 可使用 HEK293 以外的细胞线。(三) 可采用替代的转染方法, 如电穿孔或脂质体的方法。 48小时后转染, 溶解细胞, 运行蛋白凝胶, 执行西方印迹和分析蛋白质含量与抗体识别靶蛋白。目的为≥50% 的击倒效率。注: 击倒效率可以或者, 或者另外, 被评估 (i) 通过 ELISA 分析, (ii) 通过测量目标蛋白质的活动如果适用 (例如离子通道的当前密度) 或 (iii) 通过 qRT PCR 在 mRNA 水平如果适当抗体不可用 (协议步骤 3)。 将文化菜肴放在冰上, 用冰冷的磷酸盐缓冲盐水 (PBS) 清洗细胞。 吸入 PBS, 然后加入冰冷马国贤缓冲 (50 毫米三盐酸 pH 值 7.4, 150 毫米氯化钠, 2 毫米 EDTA, 1% NP40, 0.1% 月桂酸钠 (SDS), 含蛋白酶和磷酸酶抑制剂; 1 毫升为一盘的直径100毫米, 0.5 毫升为一盘直径60毫米)。 用细胞刮刀刮掉盘子上的粘附细胞, 轻轻地将细胞悬浮液转移到预冷的离心管中。 离心管在 1.5万 x g 15 分钟在4°c, 转移上清在一个新的预冷离心管和丢弃的颗粒。 使用可鉴定蛋白检测试剂盒或其他合适的方法 (例如布拉德福德化验) 确定蛋白质浓度。注: 样品可以冻结在-20 摄氏度或-80 摄氏度以后使用, 或立即处理。 将适当数量的裂解物转移到离心管, 使所有样品具有相同的蛋白质浓度, 并添加足够的冰冷裂解缓冲, 以弥补所有的裂解物到同一体积。注:30 至50µg 总蛋白应足以满足大多数蛋白质的需要, 但应根据感兴趣的蛋白质的丰度确定适当的数量。 添加适量的 2x Laemmli 缓冲液 (4% SDS, 10% 2-巯基乙醇, 20% 甘油, 0.004% 溴酚蓝, 0.125 米三盐酸, pH 6.8), 并煮沸的样品在95摄氏度为5分钟。 将样品装在丙烯酰胺凝胶上, 再加上分子量标记。用100伏的凝胶1-2 小时。注: 凝胶比例取决于感兴趣蛋白质的大小。 组装转移三明治, 并将蛋白质从凝胶转移到 100 V 的膜上2小时。膜可以是硝化棉或 PVDF。用甲醇活化 PVDF 1 分钟, 在准备堆栈前用转移缓冲器冲洗。 用阻断缓冲器 (PBST 5% 牛奶 (PBS + 0.1% Tween-20) 在室温下阻断1小时的膜, 然后在4°c 隔夜孵化膜, 并在阻塞缓冲器中稀释原抗体。 在 PBST 三次洗涤膜10分钟, 并在室温下用酶共轭二级抗体在阻塞缓冲液中孵育1小时。 在 PBS 四次清洗膜10分钟, 然后将化学发光基板应用于膜, 并使用 CCD 相机成像仪捕获化学发光信号。 使用图像分析软件对击倒效率进行量化。 选择两个最有效的大鹏靶向非重叠序列, 进一步功能化验。注意: 对于任何和平号, 非目标效果永远无法完全排除。然而, 如果两个独立的大鹏湾有类似的效果, 这是极不可能的, 这是因为一个相同的非目标击倒。 如果选定的大鹏湾的击倒效率不令人满意 (< 50%), 则为其他大鹏湾的屏幕。或者, 在串联中表示最有效的和平号,即用同一表达式卡带中的多个副本表示它们, 这可能会导致更高的击倒效率7。 2. 重组腺相关载体的构建 Optogenetic 探针和 microRNAs 的联合表达 注意: 此协议需要了解以下已建立良好的方法: 分子克隆、DNA 测序和 rAAV 生产。 将每种最有效的和平号表达式磁带复制到 3 ‘ UTR 中, 用于生产重组 rAAVs 和兴奋 optogenetic 探针的表达, 如在 pAAV-Syn-ChETA-TdT-X (图 1A) 中, 其中神经元特定的突触素启动器驱动器的表达式超快 channelrhodopsin ChETA, 红色荧光记者 TdTomato 和和平号 (s) 插入 NheI 和 EcoRI站点5 之间。注: (i) 不要超过 rAAVs 的包装限制, 它的长度大约是 4.7 Kb, 从 ITR (倒置终端重复) 到 ITR (图 1A, 橙色)。(二) 需要在停止密码子和 WPRE 之间插入和平号表达盒 (土拨鼠肝炎病毒转录后水平管理单元);图 1A)。(三) 列入荧光蛋白, 如 TdTomato, 非常有用, 因为它允许随时监测感染的局限性和强度 (议定书步骤 4)。 使用 DNA 测序验证和平号磁带的正确插入。 根据以前发布的协议8rAAV1/2 生成和滴度, 每个选定的和平号都有一个 rAAV1/2。一个典型的实验为被击倒的一个基因将包括两个独立大鹏反对同一基因和一个和平号控制。针对≥109病毒基因组 (vg)/µL 的病毒滴度。注意: rAAVs 需要在生物安全等级 1 (BSL-1) 设施中进行处理。请与机构生物安全委员会查询详细信息。注: 如果实验室没有病毒设施或病毒滴度不令人满意, rAAV 生产可以外包。例如, 访问 https://www.med.upenn.edu/gtp/vectorcore/或 https://vcf.charite.de/en/metas/。 3. 从原代神经元培养中提取 RNA qRT PCR 评价内源基因的击倒效率 注: (一) 本议定书要求了解以下已确立的方法: 初级神经元培养和 qRT PCR 的制备和维持。(二) 重复击倒效率的量化 (步骤 3.1–3.14) 至少3次 (生物复制)。(iii) 在对蛋白质含量的分析被排除时, 例如当击倒另一种拼接的亚型, 而特定抗体不可用的时候, qRT PCR 在 mRNA 水平上的分解效率是合适的, 如在敲掉5。 从感兴趣的大脑区域准备主要的神经元培养。按照以前发布的9中给出的皮层区域性的协议进行以下修改: 6井板中的板神经元, 密度为每井50万个神经元。使用2.5 毫升/井的附件介质和3.3 毫升/良好的维修介质。 如果观察到星形胶质细胞过度生长, 添加0.5 毫升/井的维护培养基补充7.5 µM 胞嘧啶β d-arabinofuranoside (为最终浓度1µM) 在3–4天体外(DIV)。 在 5-6 DIV 中,每和平号三口井 (技术复制) 感染. 使用最低的感染剂量, 这将感染神经元的≥99%. 从每个井中取出2毫升的培养基, 并在50毫升的猎鹰管中收集。 将病毒直接添加到神经元, 轻轻混合, 将盘子放回孵化器中37摄氏度。 将收集到的培养基存放在孵化器中。松开猎鹰管帽, 使气体平衡。 24小时后, 在每个井 (1.9 毫升/井) 中加入被去除的介质。 At 17-18 DIV, 溶解用于 RNA 提取的神经元.注意: 裂解试剂和氯仿具有剧毒。在化学罩下工作, 穿戴防护用具;根据您的国家和机构指南处理废物。注意: 对于步骤 3.3–3.13, 请在无 RNAse 条件下工作。戴上手套, 使用无 RNAse 玻璃器皿和一次性 plasticware。有关如何处理 RNA 的一般预防措施, 请参考 RNeasy 微手册的附录 A。 孵化玻璃巴斯德吸管一夜之间在烤箱180摄氏度。 使用与真空泵连接的玻璃巴斯德吸管, 将盘子倾斜, 从每个井中完全吸出介质。 立即添加700µL 的裂解试剂给每个井。 用手仔细地摇晃盘子, 均匀地展开溶液。 将溶液向上和向下第4-5 倍, 直至得到均匀悬浮。 把溶液从每个井转移到一个单独的1.5 毫升离心管。注: 细胞裂解物可以储存在-80 摄氏度或立即处理。 如果需要, 解冻细胞的裂解物在 RT, 并立即进行步骤3.5。 将140µL 氯仿添加到每个细胞裂解物样品中。注: 氯仿易挥发, 不易吸管, 应尽快关闭离心管。 大力摇动离心管十五年代或直到样品完全乳化。 保持样品在 RT 最小或直到液相开始分离。 离心样品在 1.2万 x g 15 分钟在4°c。 将含有 RNA 的上水相 (~ 320 µL) 转移到新的离心管上, 并丢弃剩余的液体。注: 不要接触下粉红色有机相或白色环之间的两个阶段与尖端的吸管。 在水相中加入1.5 卷100% 乙醇 (480 µL), 并将溶液慢慢向上和向下搅拌3次。 使用可用于从小样本中纯化 rna 的商用试剂盒纯化 rna。 用分光光度法定量测定 RNA 浓度和样品纯度。注: (一) 预期≥3.5 µg/井产量;260/280 和260/230 的纯度比蛋白质和有机化合物应该是≥1.9。(ii) RNA 样品可以储存在-80 摄氏度或立即处理。 Retrotranscribe 250, 500 或 1000 ng 的 RNA 与一个商业上可用的套件。 用 qRT PCR 方法定量分析感兴趣的内源基因的击倒效率。有关详细协议, 请参见引用10。针对≥60% 的击倒效率 (图 2)。将数据规范化到≥2的家政基因 (e. g。GAPDH、ACTB、TUBB3、PPIA)使用多个内部控制基因方法11。注: 如果在大鼠工作, 使用以下 PCR 引物的管家基因: GAPDH: 5 ‘ GGTGCTGAGTATGTCGTGGA 3 ‘ 和 GAPDH-转速: 5 ‘ GATGATGACCCTTTTGGC 3 ‘;ACTB: 5 ‘ CATCACTATCGGCAATGAGC 3 ‘ 和 ACTB-转速: 5 ‘ TCATGGATGCCACAGGATT 3 ‘;TUBB3-fwd: 5 ‘ GCCTTTGGACACCTATTCAG 3 ‘ 和 TUBB3-rev: 5 ‘ TCACATTCTTTCCTCACGAC 3 ‘;PPIA: 5 ‘ CACTGGGGAGAAAGGATTTG 3 ‘ 和 PPIA-转速 5 ‘ CCATTATGGCGTGTGAAGTC 3 ‘。 4. 通过对光遗传学的靶向刺激, 评估突触前蛋白在完整神经元回路中的作用 注意: 下面的协议需要以前的经验, 在急性脑切片的电生理记录和使用电生理设置。 Stereotactically 在上一个发布12中的详细协议后, 向大脑注入 rAAV1/2。使用用于鼠标13或鼠脑14的立体定向图谱确定感兴趣的大脑区域的立体定向坐标。 使用微拉拔 micropipettes 与长柄Ø7–9µm;用剪刀夹在小腿上的注射 micropipettes。使用一个薄的标记和图表纸来放置校准标记在注射 micropipettes 每2毫米。 麻醉的动物与异氟醚, 并修复它在立体定向设备。 在整个手术中保持动物的温暖, 加热垫设置在37摄氏度。 用眼润滑剂保护眼睛。 用电动剃须刀刮头上的皮毛。 用棉花芽将聚维酮碘涂在剃头上。 在解剖显微镜下, 进行中线切口。 用棉花芽清洁头骨表面, 使 bregma 和 lambda 可见。 把注射微放到它的支架上。将支架连接至立体定向臂。 确定注射相对于 bregma 和/或 lambda 的位置的 x 和 y 坐标。 用钻头将头骨薄在靶区。注意: 使用柔和的圆周运动, 避免钻过头骨, 因为这会损害大脑的表面。 如果有出血, 用毛巾纸吸收过量的血液。注意: 过量的血液会使你很难正确地确定 z 坐标。 通过毛细管作用将病毒加载≤2µL 注射微。 将注射微到注射部位的 x 和 y 坐标。 从硬脑膜中计算 z 坐标, 将吸管慢慢地移入大脑。 当达到 z 坐标时, 等待3分钟, 以允许组织调整。 使用1毫升注射器通过软管连接到注射微的背面, 应用低正压。通过解剖显微镜直观地监测注射微中病毒的射出速度, 并用标定标记作为参考点。注: 病毒需要注射在缓慢的速度 (< 100 nL/分钟), 以避免组织损伤。 注射完毕后, 等待5分钟, 取出注射微0.2 毫米, 再等5分钟, 以避免病毒回流。 从大脑中缓慢而完全地提取注射微, 并将其处理成装满漂白剂的容器。 用生理溶液将头骨湿润, 用3-4 针缝合皮肤。 将庆大霉素软膏应用于伤口。 单把动物放在一个干净的笼子里, 里面有食物小球和一盏热灯, 直到它完全恢复。 ≥15天后注射, 斩首动物下深异氟醚麻醉。 用毒气 (95% O2) 准备 Vibratome 感兴趣的脑区的急性脑切片, 5% CO2) 冰冷 aCSF 溶液, 含 (毫米): 123 氯化钠, 1.25 氯化钾, 1.25 的 2 PO 4, 1.5 氯化镁 2, 1 CaCl 2, 25NaHCO3、2 NaPyruvate 和18葡萄糖 (渗透调整为 300 mOsm)。例如, 如果目的是分析从 CA3 到 CA1 锥体神经元的突触传递, 则准备海马形成的矢状切片 (350 µm 厚)。注: 从这个步骤开始工作在低光条件下, 以避免激活 optogenetic 探头的环境光。 让切片恢复30分钟, 在37°c 在同一 aCSF 中的一个房间内设计, 以保持脑切片。将切片在室温下保持在同一脑切片室中, 直到录音。注意: 使用这些条件, 切片可以保持健康, 6–8 h。 将一个切片转移到一个浸没的记录室, 并将其与用于恢复的相同 aCSF 的2毫升/分钟 superfuse, 辅以1.5 毫米 CaCl2 (总 Ca2 +: 2.5 毫米) 和没有 NaPyruvate。注意: 切片是在低浓度的 Ca2 + (1 毫米) 中制备和维护的, 以最小化毒性。在2.5 毫米 Ca2 +中执行录制以支持囊泡释放。 简要检查表示的荧光记者的信号 (e. g。TdTomato;图 3B)确定感染的定位和强度。 用含有 (毫米) 的胞内溶液填充贴片电极: 110, 葡萄糖酸钾, 22 氯化钾, 5 NaCl, 0.5 EGTA, 3 氯化镁2, 4 毫克 ATP, 0.5 Na3-GTP, 20 K2-肌酸磷酸, 10 HEPES-KOH (pH 7.28, 290 mΩ)。注: 使用带 5–6 mΩ的吸管电阻的贴片电极。 在红外线照射下, 从受感染神经元接收突触输入的神经元中, 达到严密密封的全细胞构型。例如, 如果 CA3 锥体神经元被感染, 则在 CA1 区域的近端至内侧通道上贴上锥体神经元 (图 3C)。注意: 系列电阻可以左无偿, 但应该是恒定和低 (≤20 MΩ)。 用药理学来隔离被调查的突触电流。例如, 如果目的是研究兴奋性突触传递, 阻断抑制突触传递与10µM 荷包牡丹碱。 唤起突触电流, 例如, 兴奋性突触电流 (EPSCs), 使用 473 nm 蓝色激光耦合到光纤 (Ø≤250µm) 定位在胞体的受感染的神经元 (e.g。CA3 锥体神经元)。 将刺激长度调整到最低限度, 以减少每光脉冲产生不止一个动作电位的可能性。如果使用 ChETA, 请将其设置为2毫秒15。 调整激光的刺激强度, 以产生小而清晰检测到的突触电流 (≤50 pA 峰值振幅为 EPSCs 记录在-70 mV 之间的持有电位在 CA3 和 CA1 锥体神经元之间;图 3D)。如果使用 ChETA 和250µm 直径的光纤, 则应适当地在纤维出口1–3兆瓦的刺激强度。注: 如果激光强度不能调节, 使用中性密度过滤器。 将473纳米激光照射到受感染神经元的胞体上, 而不是它们的轴突。例如, 在 CA3 胞体上发光, 远离谢弗络, 以避免轴突的直接退极化。 应用河豚毒素 (TTX; 0.5 µM), 一个阻滞剂的钠通道, 到样品确认的渠道是行动潜力驱动。 在不同的录音中, 应用选择性阻滞剂对被调查的突触电流进行确认, 以确定刺激是选择性的。注: 例如, 将 NBQX (10 µM) 应用于 AMPA 型谷氨酸受体介导的 EPSCs。 比较在同一急性脑切片中的光学和电诱发突触电流对重复刺激 (≤20 Hz ≥2刺激) 的反应。在使用控制和平号的时候, 在电和光刺激之间应该观察到类似的突触促进或抑郁, 这就暗示了类似的细胞机制是由两种激励作用激活的。注意: 上述步骤是必要的, 以确保光刺激不会导致直接去极化突触前 boutons, 从而绕过一些机制的突触传递。 比较突触传递的反应, 以回应单一和重复刺激 (≥2在≤20 Hz) 之间的控制和平号和大鹏湾的突触前蛋白质的调查。