Hier präsentieren wir ein Protokoll für die Erkennung und Quantifizierung von niedrigen reichlich Moleküle in komplexe Lösungen mit molekularen Prägung in Kombination mit einer Kapazität Biosensor.
Die Fähigkeit zu erkennen und quantitate Biomoleküle in komplexe Lösungen seit jeher begehrte in Naturwissenschaften; für den Nachweis von Biomarkern, Schadstoffe und andere Moleküle des Interesses verwendet wird. Eine häufig verwendete Technik für diesen Zweck ist das Enzym-linked Immunosorbentprobe Assay (ELISA), wo oft ein Antikörper richtet sich an ein bestimmtes Ziel-Molekül, und ein zweite beschriftete Antikörper für den Nachweis des primären Antikörpers verwendet wird, ermöglicht die Absolute Quantifizierung von das Biomolekül unter Studie. Die Nutzung von Antikörpern als Erkennungselemente schränkt jedoch die Robustheit der Methode; genauso wie die Notwendigkeit der Verwendung von beschrifteten Moleküle. Um diese Einschränkungen zu überwinden, wurde molekulare Prägung umgesetzt, Erstellen von künstlichen Anerkennung Websites ergänzen das Vorlage-Molekül und Bilddateien die Notwendigkeit der Verwendung von Antikörpern für die erste Bindung. Darüber hinaus kann für noch höhere Empfindlichkeit, beschrifteten Sekundärantikörper von Biosensoren, die unter Berufung auf die Kapazität für die Quantifizierung des Zielmoleküls ersetzt werden. Dieses Protokoll beschreibt eine Methode, um schnell und markierungsfreie erkennen und quantitate Low-reichlich Biomoleküle (Proteine und Viren) in komplexen Proben mit einer Empfindlichkeit, die deutlich besser ist als die gängigen Systeme wie ELISA. Dies wird alles von molekularen Prägung in Kombination mit einer Kapazität Biosensor vermittelt.
Die Quantifizierung von Biomolekülen ist in vielen verschiedenen Forschungsfeldern innerhalb der Wissenschaft, die Methoden wie die Radioimmunoassay (RIA) oder ELISA1verwendet. Einige dieser Methoden erfordern eine beschriftete Reagenz wie ein Radioisotop oder Enzym beschriftet Antikörper/Antigen, wodurch sie arbeitsintensiv und zeitaufwändig mit komplexen Verfahren2. Darüber hinaus sind die Robustheit, die Selektivität und die Sensitivität dieser Methoden nicht ausreichend für alle Analysen; insbesondere sind sie nicht ausreichend, wenn Attogram Mengen werden, anstatt Piktogramm Mengen3 analysiert müssen. Zu diesem Zweck haben Biosensoren beträchtliches Interesse4,5, insbesondere in Kombination mit molekularen Prägung für eine erhöhte Robustheit gewonnen.
Molekulare Prägung stützt sich auf Hohlräume durch funktionale Monomere um die Vorlage6, Erstellen von künstlichen Anerkennung Websites, die perfekt die Vorlage7ähneln dadurch zu schaffen. Diese Technik ist für verschiedene Anwendungen, einschließlich Drug Delivery Systeme und analytischen Trennung, sondern auch als Biorecognition Elemente in Biosensoren8,9,10verwendet worden. Allerdings gibt es noch einige Schwierigkeiten bei der Gestaltung von molekular geprägte Polymere (MIPs) für makromolekulare Vorlagen wie Proteinen und Zellen11,12. Aus diesem Grund haben viele Forscher konzentrierten sich auf Prägung der Vorlage Protein direkt auf einem Substrat, wodurch eine Fläche, die von der Ziel-Protein-12erkannt wird. Diese Oberflächenbeschichtung-Technik für den Einsatz von Anerkennung Hohlräume für große Moleküle und Baugruppen einschließlich Proteine verwendet wird Microcontact Prägung13,14bezeichnet. Die allgemeine Vorgehensweise der Methode richtet sich nach der Polymerisation zwischen zwei Oberflächen – eine Vorlage-Stempel und eine Polymer-Unterstützung – auf denen die Vorlage adsorbiert an eine Oberfläche15,16und brachte in Kontakt mit der Monomer-behandelte Oberfläche. Auf diese Weise bildet sich eine dünne Polymerfolie auf die Unterstützung durch UV-Polymerisation. Schließlich wird die Vorlage entfernt, hinterlässt Vorlage bestimmte Hohlräume an der Oberfläche der aufgedruckten Elektrode. Diese Methode hat einige Vorteile, unter anderem einen reduzierte Aktivität Verlust des aufgedruckten Moleküls, sowie eine sehr geringe Mengen an Vorlage Moleküle für die Bedruckung16,17verarbeiten. Somit können diese kostengünstige, stabile, empfindlichen und selektiven Oberflächen auf die Sensorflächen, Ausrichtung auf eine Vorlage der Wahl des Benutzers erstellt werden.
Der Biosensor kann für die Erkennung von einzelnen Proteine und viel größere Biomakromoleküle, inklusive Viren verwendet werden. Eine bestimmte Gruppe von Viren, die vor kurzem Interesse zu gewinnen ist die Bakteriophagen, das ist ein Virus, der Bakterien infiziert. Schnelle und empfindliche Detektion von Bakteriophagen ist wichtig bei biotechnologischen und biopharmazeutische Prozesse um die Infektionen von Bakterienkulturen mit Bakteriophagen18zu bestimmen. Die am häufigsten verwendete biologischen Test für Bakteriophage Erkennung ist der Doppelschicht Agar Methode19, mühsam und zeitaufwendig. Mehrere Versuche wurden unternommen, neuartige Diagnose-Tools für Viren (Bakteriophagen) entwickeln wie atomic Force Microscopy (AFM)20, Interferometrie21, Elektrochemie22und Sensor System23, 24. viel Arbeit konzentrierte sich auf Biosensoren aufgrund ihrer Vorteile als einfach zu bedienen, sehr empfindlich, und in der Lage, Echtzeit-Messung15,25. Eine bestimmte Art von Biosensor basiert auf Veränderungen in der Kapazität. Diese kapazitiven Biosensoren sind die elektrochemischen Sensoren zur Messung von Veränderungen in den dielektrischen Eigenschaften wenn ein Analyten mit einem Biorecognition Element auf die Sensoroberfläche interagiert, was zu einer Abnahme der Kapazität2,4 . Kapazitive Biosensoren wurden für den Nachweis der verschiedenen Analyten wie Antigene, Antikörper, Proteine und Schwermetall-Ionen6,26,27,28verwendet. Diese Arten von Biosensoren haben viele Vorteile, wie inhärente Schnelligkeit, hohe Empfindlichkeit, Einfachheit, geringe Kosten, einfache Handhabung und Echtzeit-Messung ohne Kennzeichnung29.
Die hierin beschriebene Methode zielt zu ermöglichen die Erkennung und Quantifizierung von niedrig-reichlich Biomoleküle in hoch komplexen Proben, ohne die Notwendigkeit der Verwendung Kennzeichnung. Insbesondere eignet sich die Technik im Bereich von Atto-Picogram von Biomolekülen, wo nicht andere kommerziell vorhandene Instrumente genau ihr Ziel quantitate.
Wenn dieses Verfahren durchgeführt wird, gibt es einige wichtige Schritte, die berücksichtigt werden müssen, während im Anschluss an des Protokolls. Ein wichtiger Schritt ist die Reinigungsschritt mit sauren Piranha-Lösung. Schritt 2.1 darf nicht mehr als 10 Minuten sein. Template-Lösung für Schritt 1.4 darf 0,1 mg/mL nicht überschreiten, da diese Werte bereits optimiert wurden. Zyklische voltammetrische Scans müssen 15 Zyklen nicht überschreiten, um die optimale Dicke zu erhalten. Für Schritt 3.1.3 ist 1,5 µL einer optimierten Wert. Dieser Wert darf nicht höher für diese spezifische Art von Elektrode sein. Wenn die UV-Härtung System eine Leistung von 400 W hat, muss die Polymerisation für maximal 10-15 Minuten durchgeführt werden. Sobald die Lösung nach TEMED APS (Initiator) hinzugefügt wird, muss der nachfolgende Schritt sehr schnell durchgeführt werden, um sofortige Polymerisation (Schritt 3.2.5) zu vermeiden.
Einer der wichtigsten Schritte ist die Entfernung von der Vorlage-Stempel von der Oberfläche nach der UV-Polymerisation. Wenn dieser Schritt nicht ordnungsgemäß ausgeführt wird, gibt es ein Risiko, dass die Polymere Film auf der Oberfläche der Elektrode mit dem Stempel entfernt. Daher empfiehlt es sich, die Elektrode und der Protein-Stempel an der Spitze in einer Lösung von Wasser nach der Polymerisation eintauchen, dann entfernen die Stempel sehr langsam und vorsichtig von der Oberfläche (Schritt 3.1.6).
Basierend auf die Vorlage verwendet wird, können Änderungen in der Art und dem Verhältnis der Monomere verwendet (funktionelle Monomer und Vernetzer) im Hinblick auf die Erzeugung von höheren Empfindlichkeit bewertet werden. Dies muss empirisch ermittelt werden. Darüber hinaus beinhaltet die Affinität Bindung des Moleküls Vorlage in der Regel gleichzeitig mehrere verschiedene Interaktionen. Daher kann dies zu Problemen während der Regeneration Schritte führen. Wenn die gebundene Vorlage nicht richtig von der Oberfläche freigegeben ist, kann dies die Wiederverwendbarkeit von der Elektrode zur weiteren Analyse beeinflussen. Diese multipoint Affinitäten können auch aus der Bindung über schwächere Wechselwirkungen führen. In solchen Systemen kann unspezifische Bindung stattfinden, die die Selektivität des Systems16negativ beeinflussen können. Dies sind gewöhnliche und allgemeine, Grenzen der Methode.
Abgesehen von diesen spezifischen Einschränkungen gibt es viele wesentliche Vorteile der besprochenen Methode gegenüber bestehenden Methoden. RIAs, ELISAs und fluorometrisch Messungen sehr empfindlich sind, benötigen sie die Nutzung des beschrifteten Materials (Vorlage oder Detektor), während der Biosensor ist völlig markierungsfreie. Diese Methoden sind auch teuer und zeitaufwendig. Ein Biosensor-Ansatz ermöglicht schnelle, parallele Synthese von MIPs in verschiedenen Zusammensetzungen in der gleichen Zeit16. Da nur wenige Mikroliter Monomer-Lösung ist für die Vorbereitung erforderlich, eignet sich die Methode Verwendung teuer oder anderweitig beschränkt Monomere. Weitere, einzelne MIP-Elektroden können für ca. 80 Analysen ohne eine signifikante Abnahme der Leistung ist deutlich höher als andere vorhandene Methoden30verwendet werden. Bestehende Methoden leiden auch in unterschiedlichem Ausmaß, geringe Empfindlichkeit und Selektivität, während das beschriebene Verfahren für die Erkennung und Quantifizierung von Molekülen im Bereich von pM mit hoher Selektivität ermöglicht.
Aufgrund der Wirtschaftlichkeit, die einfache Bedienung des Instruments und die sensible Echtzeit-Erkennung in kurzer Zeit im Vergleich zu bestehenden Methoden der Biosensoren sind sehr vielversprechende Punkt der Pflege-Detection-Systeme unter Feldbedingungen; z.B.für die Umweltüberwachung und für Anwendungen in den Entwicklungsländern. In vielen Anwendungen in der Diagnose der Krankheit ist in Echtzeit, sensibel, selektive und schnelle Erkennung eines Biomarkers in einer komplexen Mischung wie Serum benötigt15,25. Biosensoren sind hier besser als bestehende Methoden, insbesondere aufgrund ihrer Robustheit und Empfindlichkeit. Speziell für den Nachweis von Infektionserregern gelten Bakteriophagen kürzlich als alternative Biorecognition Element für Biosensoren aufgrund ihrer Gastgeber Bakterien Spezifität33,34,35. Ersatz von Antikörpern mit Bakteriophagen ist sehr vielversprechend, um die Kosten zu senken und erhöhen die Stabilität noch weitere36. Ein solches System ermöglicht auch die Erkennung und Quantifizierung von spezifischen Phagen in der Umwelt und von klinischen Proben. Aufgrund der Prävalenz von Bakteriophagen und ihre Fähigkeit, Bakterien mit Antibiotika-Resistenz-Gene37,38transduzieren kann diese Methode wertvolle studieren die Verbreitung von resistenten Bakterien sein.
The authors have nothing to disclose.
Maria Baumgarten (IQ Biotechnologie Plattform, Infektion Medizin, Universität Lund) ist für die Durchführung und Bereitstellung von scanning Electron Mikrographen anerkannt. Diese Arbeit wurde unterstützt durch Zuschüsse aus The Swedish Research Council Formas (2017-00100) im Rahmen der dritten gemeinsamen Programmierung Initiative antimikrobielle Resistenz (JPIAMR) Bereitschaftsdienst “Übertragung Dynamik.” Die Geldgeber hatten keine Rolle im Studiendesign, Interpretation, schreiben, Vorbereitung des Manuskripts, Beschluss einreichen oder Entscheidung, das Werk zu veröffentlichen.
Glass Cover slips | ThermoFisher | 102222 | protein stamp |
HCl | Sigma-Aldrich | H1758-500ML | cleaning |
NaOH | Sigma-Aldrich | 72068-100ML | cleaning |
Ultrasonic cleaner | Branson Ultrasonic | BRANSONIC M1800- E | cleaning |
3-amino-propyl-triethoxysilane (APTES) | Sigma-Aldrich | A3648-100ML | modification |
EtOH | Sigma-Aldrich | 1009836010 | rinsing/cleaning |
glutaraldehyde | Sigma-Aldrich | G5882-100ML | cross-linker |
acetone | Sigma-Aldrich | 34850-1L-M | cleaning |
H2SO4 | Sigma-Aldrich | 339741-100ML | piranha solution |
H2O2 | Sigma-Aldrich | H1009-500ML | piranha solution |
tyramine | Sigma-Aldrich | T90344-5G | modification |
CompactStat | Ivium Technologies | CompactStat.h: 30mA@10V/3MHz | potentiostat |
Platinum Counter Electrode Kit | Equilabrium | AFCTR5 | potentiostat |
Reference Electrode | Equilabrium | RREF0021 | potentiostat |
acryloyl chloride | EMD Millipore | 8.00826.0100 | modification |
triethylamine | EMD Millipore | 8.08352.0100 | modification |
toluene | Sigma-Aldrich | 244511-100ML | modification |
N-hydroxymethyl acrylamide | Sigma-Aldrich | 245801-100G | functional monomer |
poly ethylene glycol-400-dimethacrylate | Sigma-Aldrich | 409510-250ML | cross-linker |
2-Hydroxy-4′-(2-hydroxyethoxy)-2-methylpropiophenone | Sigma-Aldrich | 410896-50G | functional monomer |
UV polymerizator | Dymax | Dymax 5000ECE | UV-polymerization |
forceps | Sigma-Aldrich | Z168777-1EA | consumable |
1-dodecanethiol | Sigma-Aldrich | 471364-100ML | blocking agent |
acrylamide | Sigma-Aldrich | A3553-100G | functional monomer |
N-hydroxymethylacrylamide | Sigma-Aldrich | 245801-100G | functional monomer |
N-isopropylacrylamide | Sigma-Aldrich | 415324-50G | functional monomer |
methylenebisacrylamide | Sigma-Aldrich | 146072-500G | cross-linking monomer |
N,N,N',N'-tetrametyhlethyldiamine (TEMED) | Sigma-Aldrich | T9281-25ML | catalyst |
ammonium persulphate | Sigma-Aldrich | A3678-25G | initiator |
Capacitive biosensor | CapSenze | Equipment | |
Glycine | Merck | 1042011000 | regeneration buffer |
Tween-20 | Sigma-Aldrich | P9416-50ML | regeneration buffer |
Trizma base | Sigma-Aldrich | 93352-1KG | running buffer |
Na2HPO4 • 2H2O | Calbiochem | 567547-1KG | running buffer |
NaH2PO4 • 2H2O | Calbiochem | 567549-1KG | running buffer |
DELPHI correlative light and electron microscope | Phenom-World | equipment | |
Capacitive gold electrodes | CapSenze Biosystems | consumables | |
2,2'-azobis(2-methypropionitrile) | Sigma-Aldrich | 441090-25G | photo-initiator |
CapSenze Smart Software | CapSenze Biosystems | software program |