並べ替え内皮細胞ニッチ共培養と組み合わせて 1 つのセル インデックスを使用して胚性造血幹細胞前駆体のクローン解析
Özet
ここでマウスの萌芽期の開発中に造血幹細胞前駆体のクローンの解析手法を提案する.内皮細胞共培養と表現型特性と単一造血前駆細胞の生着を潜在的な特徴への移植胚大動脈性腺発生地域から単一セルの並べ替えインデックスを組み合わせています。
Abstract
萌芽期の開発中に造血幹細胞 (HSC) の起源を調査する機能は、初期胚における HSC 前駆体の希少性と長期生着能性を識別する機能の試金の不足によって制限されており個々 の推定 HSC の前駆体。ここでは、分離・単一セルのレベルで機能的に検証された HSC 前駆体の同定を可能にする方法論について述べる。まず、駆使し個別に並べ替えの各セルの正確な表現型パラメーターをカタログにインデックス並べ替え HSC の前駆物質の実験的分析のための追加のマーカーと豊かに表現型マーカーの組み合わせを使用しています。第二に、インデックスの並べ替えの各セルは非接が HSC 前駆体多能、長期生着の潜在性と機能的な HSC の成熟を支える大動脈性腺発生 (AGM) 地域から血管性ニッチ間質との共培養移植の試金。この方法論により、機能性生着に秘めたクローン hemogenic 前駆体の表現型のプロパティまたは転写プロファイル、HSC 前駆体の詳細な分析手段を提供するなど他のプロパティの相関単一セルのレベルで開発。
Introduction
クローン研究は、高齢化1時に HSC サブタイプと HSC の動作の変更に新しい洞察力を提供する大人の HSCs の長期生着特性における不均一性を明らかにしました。ただし、胚性造血の研究およびその前駆物質によっては、難しくされています。初期胚の中に造血前駆細胞呼ばれる非定常過程の hemogenic 内皮細胞として知られている人口から生じる内皮細胞から造血転移2として。最初の HSC では、エアコンの成人のレシピエントに移植に続く堅牢で、長期の多能生着を提供するために彼らの能力によって定義されている超低周波3 でマウスの胚の胚日 10.5 (E10.5) 後まで検出されません。.HSC (pre-HSC) hemogenic 内皮細胞から発生する前駆物質開発の間に移植の試金4,5で効率的な生着を可能にする大人の HSC のプロパティを取得する前に成熟を受ける必要があります。,6。 まれな HSC の起源、赤芽球系、造血前駆細胞の多数の研究を隠すこと、骨髄性とリンパの可能性がすでに前 HSC7,8から HSC の出現する前に検出されました。したがって、事前 HSC を区別する他の造血前駆細胞クローン細胞を分離し、HSC では、移植の試金でその生着プロパティを検出するために十分な成熟のための信号を提供するためのメソッドが必要です。
Hsc の前のヴィヴォや生体内での成熟によって前 HSC の検出を実現するアプローチの数が記載されています。前のヴィヴォメソッドは、AGM 地域、開発9で最初の HSC を検出する場所などの萌芽期ティッシュの文化に依存しています。これらのメソッドは、プロトコルは、解離を組み込む建物並べ替え、および再集計 AGM 組織の許可している傍大動脈内 E11.5 E9.5 から開発中に HSC 前駆体を含む並べ替えられた個体群の特性評価splanchnopleura (P Sp)/AGM 地域4,5,10;ただし、これらのアプローチはクローン解析に必要な単一セルのレベルで前駆物質のハイスループット解析に従順ではありません。同様に、新生マウスへの移植による生体内で成熟、微小環境は HSC の前駆体の初期の段階のサポートに適して見なされどこにも有効な卵黄嚢と AGM から並べ替えられた個体群の研究/P Sp (P Sp は AGM に前駆体領域) pre-HSC では、これらのメソッドの特性とも単一の堅牢なプラットフォームを提供するために失敗する細胞分析11,12。
Rafiiらの研究は、その Akt 活性化血管内皮細胞 (EC) 間質は大人 HSC の自己複製の in vitro13,14,15のサポートのためニッチ基板を提供することができますを示しました。我々 は最近、AGM 地域 (AGM-EC) から派生した Akt 活性化 EC は適した体外ニッチ、分離早くも大人接が hsc の開発で E9 およびそれに続くのと同様、hemogenic の前駆体の成熟化の判断生成された HSC16の自己更新します。このシステムは、単純な 2次元の共培養を採用し、それは個々 に絶縁されて hemogenic 前駆体の HSC 可能性のクローン解析の容易に適応可能であります。
我々 は最近インデックスの AGM EC 共培養と移植後の機能分析とマウス胚からの個々 の hemogenic 前駆体の並べ替えを組み合わせることによりクローン hemogenic 前駆体の HSC の可能性を試金する方法を報告しています。17をの試金します。蛍光活性化のモードなどそれぞれの個別に並べ替えられたセルの表現型パラメーター (すなわち、前方散乱 (FSC-A)、側散布 (SSC-A)、蛍光パラメーター) すべて (インデックス) を記録する (FACS) をソートするセル インデックスの並べ替えは、これらの並べ替えを次以降の機能解析機能を遡及的に関連付けることができます。FACS ソフトウェアは、各セルに配置された 96 ウェル プレートの位置/よく表現型情報の両方を記録します。この手法は以前エレガントな大人の HSC の不均一性を識別、さらの HSC では、長期的な engrafting のサブセットを豊かにし、転写と HSC の表現型のパラメーターを関連付ける表現型のパラメーターを確認する使用されて1 つのプロパティはセル レベル18,19です。ここでは、胚の開発の初期段階中にユニークな表現型のパラメーターの同定と pre HSC の系統貢献を可能にするこの方法の詳細な方法論を提供します。
Protocol
Representative Results
Discussion
萌芽期の開発中に HSC 創世記の研究は、まだ移植成人レシピエントにおける血液造血系長期を提供する能力の欠けている hemogenic 前駆体の潜在的な HSC を検出するための手段を必要とします。このプロトコルで提案するクローン胚 hemogenic 前駆体法血管ニッチ ECs に間質の混合培養による HSC の前駆体の成熟化をサポートするには、AGM から移植アッセイで後続の機能解析と.設立許可の並べ替え?…
Açıklamalar
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
フレッド ハッチンソン流れ Cytometry コア援助を FACS でアンドリュー ・ ベルガー、ステイシー堂園とブライアン螺鈿に感謝したいと思います。この作業は、付属の共同助成金 #HL099997 と NIDDK 付与 #RC2DK114777 国立機関の健康 NHLBI UO1 グラント #HL100395、によって支えられました。ブランドン Hadland をサポートするには、アレックスのレモネードは、財団スタンドとホイール基礎現代希望。
Materials
| AGM-EC culture media | |||
| Materials for culture of endothelial cells | |||
| TrypLE Express | Gibco | 12605-028 | Use to dissociate AGM-EC monolayers |
| Gelatin 0.1% in water | StemCell Technologies | 7903 | Use to adhere AGM-EC monolayers to plastic |
| 96-well tissue culture plates | Corning | 3599 | Use to co-culture AGM-EC monolayers and index sorted clones |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (PBS) | Gibco | 14190-144 | Use for dissection and FACS staining |
| 500 ml filter bottles | Fisher Scientific | 9741202 | Use to sterile filter Endothelial media |
| AGM-EC culture media (500 mls) | |||
| Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM) | Gibco | 12440-053 | 400 mls |
| Hyclone Fetal Bovine Serum | Fisher Scientific | SH30088.03 | 100 mls |
| Penicillin Streptomycin | Gibco | 15140-122 | 5 mls |
| Heparin | Sigma | H3149 | 50 mg dissolved in 10 mls media |
| L-glutamine (200 mM) | StemCell Technologies | 7100 | 5 mls |
| Endothelial Mitogen (ECGS) | Alfa Aesar | J64516 (BT-203) | Add 10 mls media to dissolve and add |
| Materials for AGM index sort | |||
| Collagenase (0.25%) | StemCell Technologies | 7902 | Use for dissociation of embryonic tissues |
| 3ml syringe | BD Biosciences | 309657 | Use to sterile filter antibody solutions for FACS |
| 0.22 µM syringe-driven filter | Millipore | SLGP033RS | Use to sterile filter antibody solutions for FACS |
| 5 ml polystyrene tube with cell-strainer cap | Corning | 352235 | Use to remove cell clumps prior to FACS |
| DAPI (prepared as 1 mg/ml stock in H2O) | Millipore | 268298 | Use to exclude dead cells from sort |
| anti-mouse CD16/CD32 (FcR block) | BD Biosciences | 553141 | Use to block non-specific staining to Fc receptors |
| Antibodies for AGM index sort | |||
| Anti-mouse CD144 PE-Cyanine7 | eBioscience | 25-1441-82 | Staining |
| Rat IgG1 kappa Isotype Control, PE-Cyanine7 | eBioscience | 25-4301-81 | Isotype control for CD144 PE-Cyanine7 |
| Anti-mouse CD201 (EPCR) PerCP-eFluor710 | eBioscience | 46-2012-80 | Staining |
| Rat IgG2b kappa Isotype Control, PerCP-eFlour710 | eBioscience | 46-4031-80 | Isotype control for CD201 PerCP-eFluor710 |
| Anti-mouse CD41 PE | BD Biosciences | 558040 | Staining |
| Rat IgG1 kappa Isotype Control, PE | BD Biosciences | 553925 | Isotype control for CD41 PE |
| Anti-mouse CD45 FITC | eBioscience | 11-0451-85 | Staining |
| Rat IgG2b kappa Isotype Control, FITC | eBioscience | 11-4031-81 | Isotype control for CD45 FITC |
| AGM-serum free media (10mls) | |||
| X-Vivo 20 | Lonza | 04-448Q | 10 mls |
| recombinant murine stem cell factor (SCF) | Peprotech | 250-03 | 10 ml (100 mg/ml stock) Final concentration 100 ng/ml |
| recombinant human FLT3 Ligand (FLT3L) | Peprotech | 300-19 | 10 ml (100 mg/ml stock) Final concentration 100 ng/ml |
| recombinant human thrombopoietin (TPO) | Peprotech | 300-18 | 2 ml (100 mg/ml stock) Final concentration 20 ng/ml |
| recombinant murine interleukin-3 (IL3) | Peprotech | 213-13 | 2 ml (100 mg/ml stock) Final concentration 20 ng/ml |
| Materials for Staining co-cultured cells | |||
| 96 well plate, V-bottom | Corning | 3894 | Use for FACS analysis |
| Antibodies for analysis of Index sorted clones co-cultured with endothelial cells | |||
| Anti-mouse CD45 PerCP-Cyanine5.5 | eBioscience | 45-0451-82 | Staining |
| Rat IgG2b kappa Isotype Control, PE-Cyanine5.5 | eBioscience | 35-4031-80 | Isotype control for CD45 PerCP-Cyanine5.5 |
| Anti-mouse CD201 (EPCR) PE | eBioscience | 12-2012-82 | Staining |
| Rat IgG2b kappa Isotype Control, PE | eBioscience | 12-4031-81 | Isotype control for CD201 PE |
| Anti-mouse Ly-6A/E (Sca-1) APC | eBioscience | 17-5981-83 | Staining |
| Rat IgG2a kappa Isotype Control, APC | eBioscience | 17-4321-81 | Isotype control for Ly-6A/E APC |
| Anti-mouse F4/80 FITC | eBioscience | 11-4801-81 | Staining |
| Rat IgG2a kappa Isotype Control, FITC | eBioscience | 11-4321-41 | Isotype control for F4/80 FITC |
| Anti-mouse Ly-6G/C (Gr1) FITC | BD Biosciences | 553127 | Staining |
| Rat IgG2b kappa Isotype Control, FITC | BD Biosciences | 556923 | Isotype control for Ly-6G/C and CD3 FITC |
| Materials for tail vein injection for transplant | |||
| 1/2 ml insulin syringes with 29G 1/2" needles | BD Biosciences | 309306 | Use for tail vein injection for transplantation |
| Antibodies for Peripheral Blood analysis following translant | |||
| Anti-mouse Ly-6G/C (Gr1) PerCP | Biolegend | 108426 | Staining |
| Rat IgG2b kappa Isotype Control, PerCP | Biolegend | 400629 | Isotype control for Ly-6G/C PerCP |
| Anti-mouse F4/80 PE | eBioscience | 12-4801-82 | Staining |
| Rat IgG2a kappa Isotype Control, PE | eBioscience | 12-4321-80 | Isotype control for F4/80 PE |
| Anti-mouse CD3 FITC | BD Biosciences | 555274 | Staining |
| Anti-mouse CD19 APC | BD Biosciences | 550992 | Staining |
| Rat IgG2a kappa Isotype Control, APC | BD Biosciences | 553932 | Isotype control for CD19 APC |
| Anti-mouse CD45.1 (A20) PE-Cyanine7 | eBioscience | 25-0453-82 | Staining |
| Rat IgG2a kappa Isotype Control, PE-Cyanine7 | eBioscience | 25-4321-81 | Isotype control for CD45.1 PE-Cyanine7 |
| Anti-mouse CD45.2 (104) APC-eFluor780 | eBioscience | 47-0454-82 | Staining |
| Rat IgG2a kappa Isotype Control, APC-eFluor780 | eBioscience | 47-4321-80 | Isotype control for CD45.2 APC-eFluor780 |
| Equipment | |||
| BD FACSAria II with DIVA software | BD Biosciences | ||
| BD FACSCanto II with plate reader | BD Biosciences | ||
| Haemocytometer | Fisher Scientific | S17040 | For counting cells |
| Multi-channel pipette | Fisher Scientific | 14-559-417 | For dispensing cells |
| FACS analysis software | FlowJo/BD Biosciences | https://www.flowjo.com/solutions/flowjo | |
Referanslar
- Copley, M. R., Beer, P. A., Eaves, C. J. Hematopoietic stem cell heterogeneity takes center stage. Cell Stem Cell. 10 (6), 690-697 (2012).
- Medvinsky, A., Rybtsov, S., Taoudi, S. Embryonic origin of the adult hematopoietic system: advances and questions. Development. 138 (6), 1017-1031 (2011).
- Kumaravelu, P., et al. Quantitative developmental anatomy of definitive haematopoietic stem cells/long-term repopulating units (HSC/RUs): role of the aorta-gonad-mesonephros (AGM) region and the yolk sac in colonisation of the mouse embryonic liver. Development. 129 (21), 4891-4899 (2002).
- Taoudi, S., et al. Extensive hematopoietic stem cell generation in the AGM region via maturation of VE-cadherin+CD45+ pre-definitive HSCs. Cell Stem Cell. 3 (1), 99-108 (2008).
- Rybtsov, S., et al. Hierarchical organization and early hematopoietic specification of the developing HSC lineage in the AGM region. J Exp Med. 208 (6), 1305-1315 (2011).
- Rybtsov, S., et al. Tracing the origin of the HSC hierarchy reveals an SCF-dependent, IL-3-independent CD43(-) embryonic precursor. Stem Cell Reports. 3 (3), 489-501 (2014).
- McGrath, K. E., et al. Distinct Sources of Hematopoietic Progenitors Emerge before HSCs and Provide Functional Blood Cells in the Mammalian Embryo. Cell Rep. 11 (12), 1892-1904 (2015).
- Lin, Y., Yoder, M. C., Yoshimoto, M. Lymphoid progenitor emergence in the murine embryo and yolk sac precedes stem cell detection. Stem Cells Dev. 23 (11), 1168-1177 (2014).
- Medvinsky, A., Dzierzak, E. Definitive hematopoiesis is autonomously initiated by the AGM region. Cell. 86 (6), 897-906 (1996).
- Sheridan, J. M., Taoudi, S., Medvinsky, A., Blackburn, C. C. A novel method for the generation of reaggregated organotypic cultures that permits juxtaposition of defined cell populations. Genesis. 47 (5), 346-351 (2009).
- Yoder, M. C., Hiatt, K., Mukherjee, P. In vivo repopulating hematopoietic stem cells are present in the murine yolk sac at day 9.0 postcoitus. Proc Natl Acad Sci U S A. 94 (13), 6776-6780 (1997).
- Arora, N., et al. Effect of developmental stage of HSC and recipient on transplant outcomes. Dev Cell. 29 (5), 621-628 (2014).
- Butler, J. M., Rafii, S. Generation of a vascular niche for studying stem cell homeostasis. Methods Mol Biol. 904, 221-233 (2012).
- Butler, J. M., et al. Endothelial cells are essential for the self-renewal and repopulation of Notch-dependent hematopoietic stem cells. Cell Stem Cell. 6 (3), 251-264 (2010).
- Kobayashi, H., et al. Angiocrine factors from Akt-activated endothelial cells balance self-renewal and differentiation of haematopoietic stem cells. Nat Cell Biol. 12 (11), 1046-1056 (2010).
- Hadland, B. K., et al. Endothelium and NOTCH specify and amplify aorta-gonad-mesonephros-derived hematopoietic stem cells. J Clin Invest. 125 (5), 2032-2045 (2015).
- Hadland, B. K., et al. A Common Origin for B-1a and B-2 Lymphocytes in Clonal Pre- Hematopoietic Stem Cells. Stem Cell Reports. 8 (6), 1563-1572 (2017).
- Wilson, N. K., et al. Combined Single-Cell Functional and Gene Expression Analysis Resolves Heterogeneity within Stem Cell Populations. Cell Stem Cell. 16 (6), 712-724 (2015).
- Schulte, R., et al. Index sorting resolves heterogeneous murine hematopoietic stem cell populations. Exp Hematol. 43 (9), 803-811 (2015).
- Morgan, K., Kharas, M., Dzierzak, E., Gilliland, D. G. Isolation of early hematopoietic stem cells from murine yolk sac and AGM. J Vis Exp. (16), (2008).
- deBruijn, M. F., et al. Hematopoietic stem cells localize to the endothelial cell layer in the midgestation mouse aorta. Immunity. 16 (5), 673-683 (2002).
- Lorsbach, R. B., et al. Role of RUNX1 in adult hematopoiesis: analysis of RUNX1-IRES-GFP knock-in mice reveals differential lineage expression. Blood. 103 (7), 2522-2529 (2004).
- Holmes, R., Zúñiga-Pflücker, J. C. The OP9-DL1 system: generation of T-lymphocytes from embryonic or hematopoietic stem cells in vitro. Cold Spring Harb Protoc. 2009 (2), pdb.prot5156 (2009).
- Yoshimoto, M. The first wave of B lymphopoiesis develops independently of stem cells in the murine embryo. Ann N Y Acad Sci. 1362, 16-22 (2015).
- Kobayashi, M., et al. Functional B-1 progenitor cells are present in the hematopoietic stem cell-deficient embryo and depend on Cbfβ for their development. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (33), 12151-12156 (2014).
- Yoshimoto, M., et al. Autonomous murine T-cell progenitor production in the extra-embryonic yolk sac before HSC emergence. Blood. 119 (24), 5706-5714 (2012).
- Inlay, M. A., et al. Identification of multipotent progenitors that emerge prior to hematopoietic stem cells in embryonic development. Stem Cell Reports. 2 (4), 457-472 (2014).
- Palis, J. Hematopoietic stem cell-independent hematopoiesis: emergence of erythroid, megakaryocyte, and myeloid potential in the mammalian embryo. FEBS Lett. 590 (22), 3965-3974 (2016).
