Induisant la recombinaison Cre-lox dans le Cortex cérébral par l’intermédiaire de In Utero électroporation de souris

Générant une mosaïque génétique est un paradigme expérimental classique pour comprendre la fonction d’un gène d’intérêt. Pour déterminer si un gène est nécessaire pour un phénotype cellulaire, l’approche la plus simple est à l’origine une perte de fonction du gène dans l’ensemble de l’organisme (p. ex. knockout). Toutefois, pour déterminer si un gène est nécessaire précisément dans un certain type de cellule, Knock-out du gène dans l’ensemble de l’organisme n’est pas une approche valable. Au lieu de cela, il faut une méthode qui causera la perte de fonction d’un gène dans une cellule donnée alors qu’il est entouré par le tissu de type sauvage (c’est-à-dire génétiquement non perturbé) — en d’autres termes, création de tissus de mosaïque. Si la cellule mutante montre un phénotype mutant, mais les cellules environnantes de type sauvage n’est pas la fonction des gènes de manière autonome-cellule. Analyse du tissu de mosaïque, dans lequel les cellules mutantes sont entourés de tissu de type sauvage, est idéal pour comprendre les fonctions cellulaires-autonome des gènes, en particulier dans le cerveau où les neurones et cellules gliales forment un vaste réseau interconnecté de tissu.

Plusieurs formes de tissus cérébraux de mosaïque ont fourni des modèles puissants pour étudier les fonctions cellulaires-autonome des gènes. Études axées sur la transplantation de neurones¹, femelle mosaïcisme liée à le X^2,3,4, et le mosaïsme somatique endogène^5,6 ont tiré leurs conclusions fondées sur la mosaïque tissu cérébral. Suppression conditionnelle d’un gène par le système de recombinaison Cre-lox est une méthode qui tire pleinement parti de la grande disponibilité des lignées de souris transgéniques. Dans cette méthode, deux sites loxP sont mis en ligne sur chaque côté d’une séquence requise d’un gène (par exemple un exon), laissant flanqué de sites loxP que tous deux faire face dans la même direction (« floxed »). Recombinase cre accises la séquence entre les sites de loxP⁷. Recombinaison CRE-négociée est possible en traversant floxed souris à une autre lignée de souris exprimant la recombinase Cre avec un marqueur fluorescent dans un sous-ensemble de cellules (« ligne de journaliste Cre »). Cela a été démontré dans une variété de façons de découvrir les fonctions d’un gène dans des sous-ensembles de cellules, telles que des neurones excitateurs ou astrocytes⁸. Lignes de journaliste cre peuvent exprimer CreER^T2 pour permettre la recombinaison Cre-mediated être induit par drogue (single-neurone marquage avec masquage de Cre-mediated inductible ou SLICK)⁹. Dans une autre stratégie appelée analyse de mosaïque avec double marqueurs (MADM)^10,11, induite par le Cre interchromosomique recombinaison permet un homozygote mutant à créer aux côtés de tissu hétérozygote. Dans ces approches, une nouvelle gamme de souris doit être produite chaque fois pour chaque gène candidat ou sous-type cellulaire qui est testé. Alternativement, une recombinase Cre peut être introduite après la naissance par iontophorèse¹² ou par l’intermédiaire de vecteurs viraux (p. ex. virus adéno-associés¹³ ou lentivirus¹⁴ transportant sous-type cellulaire spécifique promoteurs). Cette stratégie crée fort et postnatale d’étiquetage. Pour cibler le développement des neurones du cortex cérébral faiblement et avant la naissance, une stratégie idéale est dans l’utérus l’électroporation de recombinase Cre avec un marqueur fluorescent.

En plus de combiner la recombinaison Cre-lox à travers dans l’utérus l’électroporation pour produire mosaïque tissu in vivo, nous introduisons plusieurs adaptations aux procédures des autres protocoles publiés^{15,16, 17,18,19,20,21}. Nous fournir des informations pour améliorer la réussite dans les enceintes chronométré femelles reproductrices. Nous exposons également nos deux stratégies pour introduire clairsemée et lumineux, marquage des neurones dans les tissus corticaux : une stratégie consiste à titrer les niveaux d’une construction unique codant pour la recombinase Cre et un marqueur fluorescent²². Une autre stratégie consiste à utiliser le système de « Supernova », conçu spécifiquement pour ces paramètres en compte^23,24. En outre, nous offrons des améliorations sur la production de pipettes de micro-injection cohérente et des simplifications à la chirurgie d’électroporation in utero . Enfin, nous décrivons les étapes critiques dans une préparation histologique simplifiée qui permet l’analyse des épines dendritiques et arbres dendritiques et axonales, sans autre coloration ou immunohistochimie.