Özet

높은 해상도 단일 셀 형태학 초파리 에서 명과의 세포 상호 작용을 공부 하 고 다 색 FlpOut 기술의 응용

Published: October 20, 2017
doi:

Özet

셀 다른 형태학을 표시 하 고 그들의 이웃과 상호 작용의 다양 한 설정. 이 프로토콜에는 단일 세포의 형태를 공개 하 고 확고 Gal4/UAS 식 시스템을 사용 하 여 세포 세포 상호 작용을 조사 하는 방법을 설명 합니다.

Abstract

셀 다른 형태학 및 복잡 한 해 부 관계를 표시합니다. 그들의 이웃과 셀 어떻게 상호 작용 합니까? 상호 작용 세포 유형 사이 또는 지정 된 형식 내에서 심지어 다릅니까? 그들은 어떤 종류의 공간 규칙을 따라 합니까? 이러한 근본적인 질문에 비보에 대 한 답변 고해상도 단일 셀 라벨에 대 한 도구의 부족으로 지금까지 방해 되어 있다. 여기, 상세한 프로토콜 멀티 컬러 FlpOut (MCFO) 기법으로 단일 세포를 대상으로 제공 됩니다. 이 방법은 3 다르게 태그 기자 (HA, 플래그 및 V5) UAS 통제 transcriptional 터미네이터 2 개의 FRT 사이트 (FRT-정지-FRT)에 의해 형벌에 의해 자동 보관을 사용 합니다. 열 충격 펄스 유도 열 충격 유도 Flp recombinase, 개별 셀에 FRT-정지-FRT 카세트를 임의로 제거 하 식: 식 또한 GAL4 드라이버를 표현 하는 셀에만 발생 합니다. 이것은 높은 해상도에서 개별 셀 형태학의 시각화 수 있는 특정된 셀 종류의 서로 다른 색된 셀의 배열. 예를 들어, MCFO 기술 초파리 두뇌의 다른 폐해의 형태학을 시각화 하기 위해 특정 glial GAL4 드라이버와 결합할 수 있습니다.

Introduction

명과, 신경 계통 (NS), 비 신경 세포 인구 했다 긴 신경 세포에 대 한 정적 프레임 워크를 제공 하 고 따라서 자세히 공부 하지 했다. 그러나, 인간, 명과 셀 NS (~ 90%)의 대다수를 구성 하 고 이다, oligodendrocytes, microglia 및 Schwann 세포를 포함 하 여 일부의 범주에 빠지다. 초파리에서 명과 NS에 있는 세포의 약 10%를 구성 합니다. 글에, 그들의 형태학과 기능 척추 동물1,2에서 발견 된 현저 하 게 유사 하다. 그들의 형태학 혈액-뇌 장벽 (BBB) 형성 epithelia, ensheathing, 사이토와 같은 셀을 포함 합니다.

다음 주 구조 이루어져 초파리 중앙 신경 시스템 (CNS): 신경 셀 시체;를 포함 하는 피 질 영역 neuropils 시 냅 스 연결 항구 다른 neuropiles; 연결 하는 크고 작은 축 삭 책자 CNS는 (그림 1)과 감각 기관과 근육을 연결 하는 주변 신경 명과 이러한 모든 해 부 구조와 관련 된 찾을 수 있습니다: 피 질 명과 (CG) 대뇌 피 질의 영역, 사이토 처럼 명과 (ALG) 및 neuropile 지역, ensheathing 명과 ensheathing 명과 (EG)에 또한 중앙 축 삭 책자와 주변 기기 연결 신경 (EGN), 그리고 마지막으로, 두 개의 시트 같은 명과, perineurial 명과 (PG) subperineurial (SPG)는 함께 전체 NS (그림 2)를 포함 하는 연속 층을 형성 하 고.

이전 연구는 명과 NS;의 개발에 중요 한 역할을 그들은 체계적으로 순환 인슐린 같은 펩 티 드에 반응 하 여 신경 세포 수를 모니터링 하 고 사이토 신경 젖 셔틀 같은 신경에 영양 지원을 제공, 먹어서3,4 여 죽어가는 신경 세포를 제거 , 5 , 6. 성숙한 NS에서 명과 BBB 유지, 신경 전달 물질을 차지 하 고 이온 항상성 유지, NS, 주요 면역 세포 대 식 세포 수 없기 때문에 BBB, 위반 시 냅 스 활동으로 동물 행동6 조절 역할 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11.

다른 폐해 하위 전문된 기능을 수행 하는 여부는 중요 한 미결 문제에 남아 있다. 그러나, 명과, 성인, 특히에 대 한 체계적인 게놈 넓은 분석 그들의 조작에 대 한 적절 한 유전 도구의 부족에 의해 방해 되어 있다. 여기, 셀 셰이프 셀을 복잡 한 상호 작용을 공부를 효율적이 고 쉬운 특성을 허용 하는 메서드가 제공 됩니다. 이 기술은 성인 초파리 뇌의 다른 폐해의 형태학 특성을 적용 하지만, 특정 GAL4 드라이버 사용에 따라 그것은 신경12,13 공부에 적응 수 있습니다. , intermingling 셀의 원리에 어떤 종류 어떤 발달 단계에 있는 조직.

Protocol

1. 멀티 컬러 FlpOut (MCFO) 실험에 대 한 준비 파리 참고: The MCFO 기술 소위 Flp 중재 중지 카세트 절단 (FlpOut)의 수정된 된 버전을 말합니다. 유전자 변형 MCFO 파리 열 충격 발기인 (hsp) 수행-Flp recombinase UAS 아래 다른 기자 제어. 각 기자 myristoylated (myr) 슈퍼 폴더 녹색 형광 단백질 (sfGFP), 피토 프 태그의는 10 년에서의 일반적인 백본 구성 됩니다 (예., 하, 플래그 또는 V5) 삽입 되…

Representative Results

이 섹션에서는 초파리 두뇌의 MCFO 기술을 사용 하 여 얻을 수 있는 결과의 예를 보여 줍니다. 그림 3 방법의 회로도 보여준다. 3 명의 다르게 막 태그 기자 (myr-smGFP-하, myr-smGFP-플래그 myr-smGFP-V5) UAS 통제 transcriptional 터미네이터 2 개의 FRT 사이트 (FRT-정지-FRT)에 의해 형벌에 의해 자동 보관 됩니다. 열 충격 펄스 유도 임의로 개별 셀?…

Discussion

이 프로토콜 높은 해상도에 관심의 조직 내에서 다른 세포 유형의 형태를 연구 하는 간단 하 고 효율적인 방법을 설명 합니다. MCFO 기술을 다른 epitope 태그로 여러 기자 색 확률적 라벨 (그림 2)에 대 한 조합에 사용 됩니다. Brainbow/Flybow15,,1617등 다른 방법과 마찬가지로 MCFO 증가 마커 coexpression 통해 레이블 …

Açıklamalar

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

저자는 아 르 님 Jenett, Aljoscha Nern, 및 조언을 루빈 연구소의 다른 회원 들과 공유 되지 않은 시 약 및 confocal 이미지를 생성 하기 위한 Janelia 비행 빛 프로젝트 팀 감사 합니다. 저자 또한 원고에 의견에 대 한 갈리아 연구소의 회원을 감사합니다.

Materials

Water bath Grant GD100
PCR tubes Sarstedt 72.737.002
Forceps Dumont 11251-20
Dissecting dish 30 mm x 12 mmm Electron Microscopy Sciences 70543-30 Glass dissection dish
Pyrex 3 Depression Glass Spot Plate Corning 7223-34 Glass dissection plates
Sylgard Black SYLGARD, Sigma-Aldrich 805998 home made with charcoal
ExpressFive S2 cell culture medium Invitrogen 10486-025
20% PFA Electron Microscopy Sciences 15713
Triton X-100 Roth 3051.3
Normal goat serum Jackson Laboratories 005-000-121
Normal donkey serum Jackson Laboratories 017-000-121
Bovine Serum Albumin Sigma A9647
Rabbit HA-tag Cell Signaling C29F4 Primary antibody, dilution 1:500
Rat FLAG-tag Novus Biologicals NBP1-06712 Primary antibody, dilution 1:100
Mouse V5-tag:DyLight 549 AdSerotec 0411 Conjugated antibody, dilution 1:200
anti-rabbit AlexaFluor 488 Invitrogen A11034 Secondary antibody, dilution 1:250
anti-rat DyLight 647 Jackson Laboratories 712-605-153 Secondary antibody, dilution 1:100
Vecta Shield Vector Laboratories H-1000
SlowFate Gold Invitrogen S36937
Secure Seal Spacer Grace Biolabs Contact company for ordering
Microscope cover glass 22 X 60 mm Marienfeld 101152
Microscope cover glass 22 x 22 mm Roth H874
Stereo Microscope, Leica MZ6 Leica
Confocal laser scanning microscope LSM710 Zeiss
Immersol Zeiss 518 F Immersion oil for fluorescence-microscopy, halogen free
Immersol Zeiss W 2010 Immersion fluid for water-immersion objectives, halogen free
R56F03-GAL4 (EG) Bloomington Stock Center 39157 GAL4 driver
R86E01-GAL4 (ALG) Bloomington Stock Center 45914 GAL4 driver
hspFlpPestOpt; UAS-FRT-stop-FRT-myr-smGFP-HA, UAS-FRT-stop-FRT-myr-smGFP-FLAG, UAS-FRT-stop-FRT-myr-smGFP-V5 Bloomington Stock Center 64085 UAS reporter (https://bdscweb.webtest.iu.edu/stock/misc/mcfo.php)
Fiji (Image J) Image analysis software
Multi Time Macro Zeiss Software for automated scanning

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