Özet

Alimentación dieta alta en grasas y alto rendimiento Triacylglyceride ensayo en Drosophila Melanogaster

Published: September 13, 2017
doi:

Özet

Se trata de una dieta alta en grasas alimentación protocolo para inducir obesidad en Drosophila, un modelo de mecanismos moleculares fundamentales comprensión implicados en la lipotoxicidad. También proporciona un análisis de alto rendimiento triacylglyceride para medir la acumulación de grasa en Drosophila y potencialmente otros modelos (insectos) en diversas condiciones de dieta, ambientales, genéticas o fisiológicas.

Abstract

Enfermedad cardíaca es la causa número una de muerte humana en todo el mundo. Numerosos estudios han demostrado fuertes conexiones entre la obesidad y fallo cardíaco en los seres humanos, pero se necesitan más herramientas y esfuerzos de investigación para dilucidar mejor los mecanismos implicados. Para más de un siglo, el modelo genético altamente manejable de Drosophila ha sido fundamental en el descubrimiento de genes clave y vías moleculares que demostró ser altamente conservadas entre especies. Muchos procesos biológicos y mecanismos de la enfermedad se conservan funcionalmente en la marcha, como el desarrollo (p. ej., plan de cuerpo, corazón), cáncer y enfermedades neurodegenerativas. Recientemente, el estudio de la obesidad y patologías secundarias, tales como enfermedades del corazón en organismos modelo, ha desempeñado un papel muy importante en la identificación de los principales reguladores implicados en el síndrome metabólico en los seres humanos.

Aquí, nos proponemos utilizar este organismo modelo como una herramienta eficaz para inducir la obesidad, es decir, la acumulación excesiva de grasa y desarrollar un protocolo eficiente para monitorear el contenido de grasa en forma de acumulación de TAGs. Además de altamente conservado, pero menos complejo genoma, la mosca también tiene una vida útil corta para la experimentación rápida, combinada con la rentabilidad. Este documento proporciona un protocolo detallado para la alimentación de la dieta de grasa alto (HFD) en Drosophila para inducir a la obesidad y un análisis de alto rendimiento triacylglyceride (etiqueta) para medir el aumento asociado en contenido de grasa, con el objetivo de ser altamente reproducibles y eficiente para la detección genética o química a gran escala. Estos protocolos ofrecen nuevas oportunidades para eficiente investigar mecanismos regulatorios involucrados en la obesidad, así como proporcionar una plataforma estandarizada para la investigación de descubrimiento de drogas para la prueba rápida del efecto de fármacos candidatos en el desarrollo o prevención de la obesidad, diabetes y enfermedades metabólicas relacionadas.

Introduction

Estamos en un momento donde la obesidad y sus cargas económicas asociadas, es un problema mundial1. Dos de cada tres estadounidenses tienen sobrepeso u obesidad con cardiopatías relacionadas, la principal causa de muerte en la población adulta de2. Se necesitan nuevos métodos eficientes para investigar adecuadamente los componentes genéticos y moleculares implicados en la regulación del síndrome metabólico utilizando organismos modelo. Por esta razón, elegimos el modelo de Drosophila mosca de la fruta porque comparte los procesos biológicos más básicos con los mamíferos, como ratones y seres humanos3,4,5,6. Genoma de drosophilaes altamente conservados durante la evolución, pero en general mucho más pequeña con menos duplicación del gene y complejidad metabólica, lo que es ideal para la comprensión de los mecanismos fundamentales implicados en muchas enfermedades humanas4 , 7 , 8. Asimismo, procesos característicos realizados por el tejido adiposo, intestino y páncreas están representados en la marcha y mediar funciones reguladoras en el metabolismo de glucosa y de lípido, por ejemplo, que son similares a los seres humanos9, 10,11. Por otra parte, las vías moleculares básicas implicados en el control de la obesidad, resistencia a la insulina y la diabetes en los seres humanos son funcionalmente conservadas en Drosophila melanogaster12,13,14 , 15 , 16. como organismos superiores, Drosophila tiene un corazón que se forma durante el desarrollo de procesos similares a la de los mamíferos corazón3,17. Así, el desarrollo de un confiable HFD alimentación protocolo y ensayo de etiqueta de alto rendimiento, adaptado para los propósitos de la investigación eficiente utilizando la caja de herramientas genética de Drosophila, proporcionan un medio importante para estudiar y comprender la base genética fundamental subyacente a enfermedades metabólicas complejas.

La comida HFD sí mismo se hace de un alimento mosca de laboratorio estándar suplementado con aceite de coco, que se compone principalmente de ácidos grasos saturados sabidos para ser asociado con síndrome metabólico18. Mientras que inducir obesidad en modelos de mamíferos, como roedores, puede tomar meses19,20, nuestro HFD optimizado protocolo de alimentación en Drosophila efectiva y reproducible aumenta la grasa en cuestión de días12,14. Este protocolo, junto con un análisis de alto rendimiento etiqueta, permite la investigación total eficaz para los efectos de factores genéticos, influencias ambientales y los candidatos de la droga para descubrir nuevos moduladores del metabolismo de las grasas. En consecuencia, estos protocolos son probablemente relevantes para entender y combatir la obesidad y patologías humanas asociadas a la obesidad.

El protocolo de alimentación es versátil y se puede aplicar para estudiar los efectos metabólicos y funcionales de solo ácidos de grasos saturados o insaturados. El uso de este análisis de etiquetas de alto rendimiento no se limita a la D. melanogaster, pero puede ser adaptado a una variedad de organismos modelo pequeño con cutícula o matrices extracelulares difíciles (p. ej., otras especies de Drosophila , C. elegans y otros organismos invertebrados modelo) para medir el contenido de grasa en diferentes condiciones ambientales, genéticas o fisiológicas, en cualquier etapa del desarrollo, la adultez o fase de enfermedad metabólica. El ensayo de la etiqueta se basa en una medición colorimétrica de una serie de reacciones enzimáticas que degradan las etiquetas en ácidos grasos libres, glicerol glicerol 3-fosfato y finalmente H2O2 reacciona con 4-aminoantipirina (4-AAP) y 3,5- Dicloro-2-hidroxibenceno sulfonato (DHBS 3,5) para producir un producto de color rojo que se mide mediante un espectrofotómetro de 96 pocillos.

Protocol

1. HFD protocolo de alimentación tabla 1. Receta de comida mosca. Esta tabla resume los diferentes ingredientes utilizados para preparar nuestro control alimentos. Una vez hecho, 10 mL del alimento se vierte en frascos, enfriado y almacenado a 4 ° C para almacenamiento a largo plazo. Preparación de HFD para hacer 1 kg de alimentos grasa, pesan 700 g de moscas…

Representative Results

En D. melanogaster, como es el caso con otras especies Existe dimorfismo sexual entre machos y hembras22. Es bien sabido que las hembras son más grandes, con más grasa en su abdomen que los machos22. Para probar la efectividad de nuestro protocolo, realizamos ensayos de etiqueta para determinar las diferencias en el contenido de la etiqueta entre machos y hembras de laboratorio estándar wildtype (w1118) vuela….

Discussion

La inducción de la obesidad en ratones puede tomar meses19,20. En moscas, este HFD protocolo de alimentación permite la inducción de la excesiva acumulación de grasa en cuestión de días o menos, causando aumento en la acumulación de grasa solamente después de 18 h (ver figura 2). HFD de alimentación con el protocolo descrito aumenta glucosa contenido 12 y disminuye Bmm lipasa y de la expresi?…

Açıklamalar

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Nos gustaría dar las gracias a Erika Taylor para la edición de este manuscrito. Este trabajo fue financiado por subvenciones de los institutos nacionales de salud (P01 HL098053, P01 AG033561 y HL054732 R01) a R.B., un suplemento de investigación post-doctoral (R01 HL085481) y compañerismo (AAUW) a S.B.D. y becas de la American Heart Association a S.B.D. y R.T.B.

Materials

Talboys Ball dropper/bead Dispenser Talboys #: 930150
Talboys High Throughput Homogenizer Talboys #: 930145
Grinding Balls, Stainless Steel  OPS Diagnostics, LLC # GBSS 156-5000-01 5000 balls
Masterblock 96 Well deep Microplates Greiner Bio-One # T-3058-1 case of 80 plates
Greiner  96 well microplate flat bottom Sigma Aldrich # M4436 40 plates
Greiner CapMat for sealing multiwell plates Sigma Aldrich # C3606 50 sealing plates
Reagent Reservoirs  Thomas Scientific # 1192T71 12/PK
Thermo Scientific Finnpipette 4661040 Thermo Scientific # 4661040 1-10 ul multipipette
Thermo Scientific Finnpipette 4661070 Thermo Scientific # 4661070 30-300ul multipipette
Thermo Scientific Finnpipette 4661020 Thermo Scientific #4661020 10-100ul multipipette
Multichannel tips Denville Scientific Inc # P3131-S for 10 uL pipette
Multichannel tips Denville Scientific Inc # P3133-S for 200 uL pipette
Multichannel tips Denville Scientific Inc #P1125 for 100 uL pipette
Forceps  Roboz Surgical # 5 Dumonts Super fine forceps
Mettler Toledo Excellence XS Analytical Balance Mfr# XS64 Cole-Parmer scientific experts # EW-11333-00
Metler Toledo Excellence XS Toploading Balance Cole-Parmer scientific experts # EW-11333-49
96-Well microplate Centrifuge Hettich Zentrifugen # Rotina 420R
Microplate Reader Molecular devices # SpectraMax 190
Lab-Line Bench Top Orbit Environ Shaker Incubator Biostad # 3527
Infinity Triglycerides reagent Thermo Scientific # TR22421
Triglyceride Standard Stanbio #2103 – 030
Quick Start Bradford Protein Assay Bio-RAD # 500-0205 1x dye Reagent
Coconut oil Nutiva # 692752200014 15 0z jar
PBS 10X Thermo Scientific # AM9625 500 ml
Triton X-100 Sigma Aldrich # 9002-93-1
Gas-permeable Foil Macherey-Nagel # 740675 50 pieces
filter Paper VWR # 28317-241 Pack of 100
Drosophila vials Genesee Scientific Cat #: 32-116SB
Quick Start Bovine Serum Albumin Standard Bio-Rad # 5000206
FlyNap Anesthetic Carolina # 173025 100 mL
Kimwipes Low-Lint Uline # S-8115 1-Ply, 4.4 x 8.4"

Referanslar

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Bu Makaleden Alıntı Yapın
Diop, S. B., Birse, R. T., Bodmer, R. High Fat Diet Feeding and High Throughput Triacylglyceride Assay in Drosophila Melanogaster. J. Vis. Exp. (127), e56029, doi:10.3791/56029 (2017).

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