Describimos una nueva técnica experimental que llamamos mínimamente invasiva del músculo incrustación (MIME), que se basa en la evidencia que el tejido muscular esquelético contiene células viables miógenas que pueden facilitar la miogénesis mediada por células de donantes cuando están implantados en un músculo de host.
Músculo esquelético posee capacidad regenerativa debido a residente de tejido, generadoras de fibra muscular (miógenas) satélite células (SCs), que pueden formar nuevas fibras musculares bajo las condiciones adecuadas. Aunque SCs pueden cosecharse de tejido muscular y cultivan en vitro, las células mioblastos resultante no son muy eficaces en la promoción de miogénesis cuando trasplantó en músculo de host. Quirúrgico exponiendo el músculo host e injerto de segmentos de tejido donante, o las fibras musculares aisladas con sus SCs en músculo de host, promueve mejor miogénesis en comparación con el trasplante de mioblastos. Hemos desarrollado una técnica novedosa que llamamos mínimamente invasiva del músculo incrustación (MIME). MIME consiste en pasar una aguja quirúrgica a través del músculo de host, dibujo un pedazo de tejido del músculo donante a través de la pista de la aguja y entonces dejando el tejido donante incrustado en el músculo de host que puede actuar como una fuente de SCs para el músculo del host. Aquí describimos detalladamente los pasos involucrados en la realización de MIME en un modelo de ratón inmunodeficiente que expresa una proteína fluorescente verde (GFP) en todas sus células. Inmunodeficiencia en el ratón de host reduce el riesgo de rechazo inmunológico del tejido donante y expresión de GFP permite la identificación fácil de las fibras de músculo de host (GFP +) y fibras musculares derivadas de células donantes (GFP-). Nuestros datos experimentales sugieren que MIME puede utilizarse para implantar un músculo extensor digitorum longus (EDL) de un ratón de donantes en el tibial anterior (TA) músculo un ratón anfitrión. Nuestros datos también sugieren que cuando un myotoxin (cloruro de bario, volver2) se inyecta en el músculo de host después de MIME, hay evidencia de miogénesis derivados de la célula donante en el músculo de host, con aproximadamente 5%, 26%, 26% y 43% de las fibras en un solo host TA músculo que muestra la no contribución de host, host mínimo contribución, contribución moderada de host y host máxima contribución, respectivamente.
Músculo esquelético sano, aunque poste-mitotic, posee excelente capacidad de regeneración debido a la presencia de tejido-residente miógenas células conocidas como células satélite (SCs)1,2; y ha comentado en3,4. Sin embargo, bajo condiciones patológicas causadas por distrofias musculares, traumas o envejecimiento acelerado, la regeneración del músculo podría no continuar con la degradación muscular, y por lo tanto, ocurre una pérdida de fibra muscular progresiva5. Aunque se han desarrollado métodos efectivos para aislar SCs del músculo y ampliar en la cultura para generar gran número de mioblastos (y posteriormente miotubos), intenta generar fisiológicamente relevantes números de fibras musculares en el músculo de host tienen rindió solamente éxito mínimo6. Como con muchos otros tipos de células, cuando mioblastos se inyectan solo en tejido anfitrión, la mayoría de las células no engraft7,8. Hemos demostrado que la estimulación eléctrica neuromuscular (NMES) facilita la miogénesis derivados de la célula donante en músculo de ratón deficiente regeneración anfitrión que fue inyectado con mioblastos humanos8. Otros han demostrado que quirúrgico injerto músculo hecho una biopsia o solo las fibras musculares con SCs adjuntos, facilitar la miogénesis moderada sin NMES, sugiriendo que podría ser más ventajoso que implantar implantar toda las fibras musculares con SCs miogénica de las células solo9,10. Como donante o ingeniería tejido injertado en músculo de host produce mejores resultados que el trasplante las células solas, es posible que tejidos o estructuras del tejido pueden proporcionar señales cruciales para el engraftment de la célula donante; un concepto que se está convirtiendo en cada vez más evidente en estudios de terapia celular con varias células tipos10,11,12.
Los datos recientes sugieren que SCs obtenidas de seres humanos más de 2 semanas post mortem generan miotubos en cultura13. Por lo tanto, nos proponemos evaluar si la implantación del músculo tejido cosechado post mortem en un anfitrión vivo invertirá pérdida de fibra muscular. Hemos desarrollado una técnica novedosa llamada MIME para implante del tejido muscular donante en tejido de músculo esquelético de un anfitrión vivo para promover la miogénesis derivados de la célula donante. MIME consiste en pasar una aguja quirúrgica a través del músculo de host para crear una pista de la aguja; dibujo de un pequeño segmento de tejido del músculo donante a través de la pista de la aguja; dejando el tejido donante incrustados en el músculo del anfitrión; y cerrar los orificios de aguja con adhesivo tisular. Después de practicar la técnica en ratones eutanasia estudió en otros experimentos, han realizado ahora MIME en vivo ratones que son inmunodeficientes y ubicuo expresan una proteína fluorescente verde (GFP), y seguimiento a los 3 y 14 días post-MIME. En el mimo después de 3 días, confirmamos que músculo EDL de ratón (GFP-) donante implantado en ratón anfitrión músculo (GFP +) TA, restos incrustados en el músculo de host. En el mimo después de 14 días, después de volver2 myotoxin lesión para inducir daño y miogénesis, confirmamos que aproximadamente 5%, 26%, 26% y 43% de las fibras en un solo host músculo TA no mostrar contribución acogida, contribución mínima host, host moderada contribución y la máxima sede de contribución, respectivamente. Nucleación central (un marcador de degeneración y regeneración posterior) se ve en aproximadamente el 95% de las fibras musculares de TA después de la inyección de MIME y myotoxin.
Estudiamos los músculos TA 14 días después de MIME + volver2 porque este momento capta la etapa intermedia de la regeneración, cuando una mayoría de las fibras regeneradas son nucleated centralmente. Estudiamos GFP + ratones como anfitriones para MIME, para que cuando nos finalmente trasplante de músculo humano cadavérico en ratones host, seamos capaces de distinguir fácilmente las fibras musculares de origen del host y de los donantes. Utilizamos el ratón músculo EDL como el tejido donante experimental, puesto que solo fibras de este músculo han mostrado mayor potencial miógeno que TA músculos9. El músculo EDL también es sinérgico con el músculo de la TA y tiene similar composición del tipo de fibra. Nuestros datos preliminares sugieren que MIME es capaz de facilitar la miogénesis derivados de la célula donante en el músculo de host.
Aquí, presentamos un protocolo detallado para la nueva técnica experimental conocido como mimo, desarrollado en nuestro laboratorio, implante del tejido muscular donante en el tejido muscular de host. Se trata de una adaptación de un músculo abierto injerto técnica que ya ha demostrado ser eficaz en la promoción de miogénesis mediada por células de donantes en un host músculo9,10,17.
El objetivo de MIME es no permitir el injerto del donante tejido muscular sí mismo en el músculo de host (en la actualidad no sabemos si esto ocurre), sino proporcionar una fuente de donantes SCs que pueden contribuir a la miogénesis en el músculo de host en condiciones que estimulan la m uscle regeneración. Nuestra esperanza es que después de MIME ha sido optimizado y probado en estudios básicos y preclínicos, podría proporcionar información valiosa para dirigir terapias clínicas destinadas a aumentar la regeneración muscular en los músculos esqueléticos que han sufrido pérdida de masa muscular miogénicos.
Hay numerosas preguntas que todavía no han contestado con respecto a cómo MIME podría traducirse en una terapia clínica, por ejemplo: ¿Cómo controlamos la calidad de tejido del donante? ¿Cómo controlamos rechazo inmune de células y tejido del donante? ¿Se borra el tejido donante después de prever las células miogénesis o sale detrás de una cicatriz fibrótica? ¿Afecta el tipo de fibra del músculo donante o host de la miogénesis mediada por células de donante? ¿Que los músculos pueden beneficiarse prácticamente de MIME? Estamos ampliando nuestros estudios para evaluar si MIME es segura y eficaz, identificar los tratamientos adyuvantes que pueden aumentar miogénesis derivados del donante y responder a muchas de las preguntas mencionadas anteriormente.
Después de completar nuestras pruebas del trasplante allogeneic de ratón a ratón con MIME, nuestro siguiente paso es hacer humanos a ratón MIME con tejido humano cadavérico para evaluar el potencial miógeno de tejido cadavérico. Esperamos que estos experimentos conducirá a una nueva línea de investigación básica y traslacional, que consiste en tejido fino del músculo de los donantes, que se registre en iniciativas como el programa de legado de cuerpo para la educación y el programa regalo de vida para la donación de órganos .
Los datos representativos presentados en este manuscrito sugieren que a los 14 días después de MIME, hay varios myofibers viables que carecen de GFP o tienen niveles bajos de GFP. Nuestra interpretación de estos datos es que las células satélite de GFP-donantes contribuyeron a la miogénesis en el músculo de host. Realizamos este experimento en preparación para la implantación de tejido cadavérico humano en un músculo de ratón de host. Para demostrar inequívocamente que las células satélite de donantes contribuyen a la miogénesis en el músculo de host después de MIME, sería útil implantar tejido donante que expresa de un reportero fluorescente, que puede ser fácilmente distinguido de GFP (p. ej., rojo fluorescente proteína expresando tejido donante implantado en GFP + músculo host).
Esta técnica está limitada principalmente por la naturaleza de la SCs en el tejido del donante. Si el SCs en el tejido del donante son viable, que la técnica es probable facilitar miogénesis mediada por células de donantes, mientras que si no son viables, no pueden ocurrir la miogénesis. Sin embargo, ya que SCs son muy resistentes y viables para aproximadamente 2 semanas post-mortem, es muy probable que para los propósitos experimentales, el tejido donante que se implanta dentro de unos minutos después de la cosecha facilitará la miogénesis mediada por células de donantes13 . Además, como se refirió anteriormente, es posible que desde el tejido de músculo entero (que contiene SCs, madurez de las fibras musculares, así como fibroblastos reside en el músculo) se encaja en el músculo de host, la fibrosis puede ocurrir. Sin embargo, esta hipótesis debe examinarse empíricamente. La literatura sobre daño de músculo por contracciones perjudiciales, criocauterización y miotoxinas experimentales, sugiere que las células inmunes (principalmente macrófagos) son capaces de efectivamente claro detritos celulares de las fibras dañadas y remodelación de la matriz extracelular18. Por lo tanto, es posible que después de la inyección de2 MIME y volver, siempre y cuando las células inmunes del anfitrión tienen a degeneración fibras del músculo donante, podrían despejar escombros, dejando sólo el donante SCs. Finalmente, la magnitud de la miogénesis derivados del donante es dependiente en la cantidad de tejido donante que se incrusta en el músculo de host. En orden para el compartimiento del músculo host a ser completamente repoblada por myofibers derivados de la célula donante, se necesitaría un método como X o gamma-irradiación a ablar músculo host SCs y también requiere procedimientos repetidos de MIME.
Se ha demostrado que exponer quirúrgicamente un músculo host y suturar de un pedazo de tejido del donante en el músculo de host pueden facilitar la miogénesis mediada por célula donante9,10,17. Este abordaje quirúrgico abierto se ha utilizado en el pasado para seguir la progresión de la miogénesis y generar modelos murinos de enfermedades del músculo humano. El aspecto innovador de la técnica de mimo es que es mínimamente invasiva y no implica exponer quirúrgicamente el músculo de host. Esto reduce el riesgo de infección iatrogénica y el grado de malestar en el animal del anfitrión, por lo tanto lo que es más factible realizar MIME repetidamente en el mismo músculo de host si es necesario.
Anticipamos que la técnica del mimo podría ser un adecuado refinamiento para el abordaje quirúrgico abierto que actualmente se sigue para implantar tejido donante en un ratón de host. Esto podría acelerar la generación de modelos de ratón humanizado, incrustando una biopsia muscular humano en músculo de ratón del host. Además, basado en nuestros datos preliminares de injerto de ratón a ratón, Anticipamos que MIME será efectiva en lograr la miogénesis mediada por células de donantes de tejido de donante cadavérico humano como donante SCs son viables. Por último, con las pruebas adicionales y validación, esperamos que la técnica de mimo le ayudará a desarrollar nuevas terapias para facilitar la miogénesis mediada por células de donantes en los seres humanos con enfermedades musculares.
El éxito de la técnica de mimo depende críticamente precisamente incrustar el tejido donante dentro del compartimiento fascial (epimysium) del músculo del host. Sólo si el tejido donante se coloca dentro del compartimiento del músculo de anfitrión, será capaz de proporcionar SCs al músculo del host de manera precisa. Si el tejido donante se coloca fuera del músculo de host, no está claro en cuanto a lo que sería su destino. En nuestro modelo experimental de mimo, utilizamos el músculo TA como el músculo de host, ya que es destacado y colocado superficialmente en el aspecto anterolateral de la pierna. El tamaño, la orientación y la posición anatómica de los músculos TA, hace fácil confirmar que el tejido del donante es colocado correctamente dentro del músculo de host TA después de MIME. En este trabajo, hemos proporcionado evidencia experimental de que el tejido del donante rered incorporada en el host músculo TA en MIME después de 3 días y allí es miogénesis mediada por células de donantes en el músculo de host en el mimo después de 14 días.
The authors have nothing to disclose.
Este trabajo fue posible por una beca de piloto de la Alianza para Investigación Regenerativa de rehabilitación y formación (AR3T) y un paquete de inicio de la Facultad de la Wayne State University al bote. AR3T es apoyado por Eunice Kennedy Shriver Instituto Nacional de salud infantil y desarrollo humano (NICHD), Instituto Nacional de desórdenes neurológicos y movimiento (NINDS) y National Institute of Biomedical Imaging y bioingeniería (NIBIB ) de los institutos nacionales de salud bajo la concesión número P2CHD086843. El contenido es responsabilidad exclusiva de los autores y no representan necesariamente las opiniones oficiales de los institutos nacionales de salud.
NSG-GFP mice | The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME) | Stock #021937 | Immunodeficient host mice that ubiquitously express green fluorescent protein |
C57BL/6J mice | The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME) | Stock #000664 | Control donor mice |
Tabletop isoflurane vaporizer | VetEquip (Livermore, CA) | Item #901801 | Inhaled anesthesia system |
Magic depilatory crea | Softsheen Carson (New York, NY) | N/A | Razorless hair removal cream |
4-0 Silk, black, braided, non-absorbable sutures | Roboz Surgical Instrument Co, Inc. (Gaithersburg, MD) | SUT106631 | Guiding sutures for donor tissue |
VetBond veterinary tissue adhesive | 3M (Maplewood, MN) | Catalog #1469Sb | Veterinary tissue adhesive for sutureless skin closure |
Barium chloride | Ricca Chemical Company (Arlington, TX) | Product #R0854000-500A 854-16 | Myotoxin to induce muscle damage and stimulate regeneration |
Deltaphase isothermal gel heating pad | Braintree Scientific (Braintree, MA) | Item #39DP | Heating pad to provide thermal support to animals while under anesthesia |
HM525NX cryostat | ThermoFisher (Waltham, MA) | Catalog #HM525NX | Cryostat to make frozen sections of muscle |
Vectashield Antifade Medium | Vector Laboratories, Inc. (Burlingame, CA) | Catalog Number: H-1000 | Antifade medium to preserve fluorescence in immunofluorescently labeled samples |
Rabbit anti Desmin Antibody | Labvision Thermo Scientific (Fremont, CA) | RB9014P | Rabbit anti desmin antibody for desmin immunofluorescent labeling |
Goat anti Rabbit Alexa 568 Antibody | ThermoFisher (Waltham, MA) | Catalog#: A-21069 | Goat anti rabbit secondary antibody for desmin immunofluorescent labeling |
4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Seracare (Milford, MA) | Catalog #5930-0006 or 71-03-01 | Reagent for fluorescent labeling of nuclei |
Axio Scope.A1 microscope | Carl Zeiss (Peabody, MA) | Product #Axio Scope.A1 | Light and fluorescence microscope |
Photoshop CS4 | Adobe Systems (San Jose, CA) | Photoshop CS4 | Imaging Software for perform image tiling |
Image J | National Institutes of Health (Bethesda, MD) | Image J for Windows 64-bit Operating System | Imaging Software for quantitative fluorescence analysis |