여기, 선물이 프로토콜을 이식, 허용 오차를 유발 하 고 생체 외에서 그리고 vivo에서 평가 받는에서 고유한 셀 하위 집합의 진압 용량 및 기증자 또는 외 인 항 원 받는 사람의 면역 상태.
이식에서 주요 관심사는 규정 하는 세포의 유도 통해 특정 공차를 달성 하기 위해입니다. 허용 오차 메커니즘의 이해 안정적인 모델을 필요합니다. 여기, 우리 costimulation 신호 봉쇄 또는 유전자 전송을 통해 immunoregulatory 분자의 upregulation에 의해 유도 된 쥐에 심장 이식에 관용의 모델을 설명 합니다. 이 모델의 각 규제 T 세포 (Tregs), 규정 하는 B 세포 (Bregs) 등 규제 골수성 세포 (RegMCs) 규정 하는 세포의 생체 내에서 세대 수 있습니다. 이 원고에서 식별 하 고 관용 유도 및 유지 관리. 에 그들의 책임을 확인 하기 위해 생체 외에서 그리고 vivo에서 규제 세포 활동을 정의 하는 데 사용 된 두 개의 보완 프로토콜 설명 첫째, 생체 외에서 진압 분석 결과 복용량 의존 방식에서 이펙터 면역 반응에 진압 용량 세포의 급속 한 식별을 허용 하 고 cytokine 측정 또는 세포 독성 등 추가 분석에 사용할 수 있습니다. 둘째, 새로 비친된 이식할된 받는 사람에 게 관용 대우 받는 사람에서 세포의 입양 전송 감독 이식 면역 반응 제어 및/또는 변환 하는 새로운 규정 하는 세포 (이러한 셀의 tolerogenic 속성을 강조 되 나 전염 성 관용). 이러한 방법은 알려진 phenotypic 표식이 셀에 제한 되지 않으며 모든 세포 인구를 확장할 수 있습니다. 또한, 기증자 감독 규제 셀 (필드에 중요 한 목표)의 allospecificity 제 3 자 기증자 세포를 사용 하 여 평가 될 수 있다 또는 이식 체 외에서 또는 vivo에서. 마지막으로,이 규정 하는 세포의 특정 tolerogenic 용량을 확인 하려면 우리 체액 항 기증자 항 체 반응과 새로운 또는 이전 알려진된 항 원에 대 한 체액 응답을 개발 하는 받는 사람의 용량을 평가 하기 위해 프로토콜을 제공 합니다. 설명 하는 관용의 모델 추가 규제 셀, 새로운 생체 및 immunoregulatory 분자 식별 하 하 사용할 수 있습니다 그리고 다른 이식 모델 또는 쥐 또는 인간 자기 면역 질병에 적응할 수 있다.
쥐의 심장 이식 관용 유도 및 유지 관리의 메커니즘을 해독 하는 관용 유도 치료를 평가 하기 위해 신뢰할 수 있는 장기 이식 모델 이며 기능적으로 유능 하 고 지배적인 규정 하는 세포를 유발 가능성이 있다. 프로토콜 아래 루이스 1A 받는 사람 쥐 (LEW.1A, RT1는는)으로 완벽 하 게 불일치 heterotopic 심장 이식 루이스 1W 기증자 쥐 (LEW.1W, RT1u)에서 설명합니다. 이 이식 조합에서 급성 거부 빠르게 (약 7 일)에서 발생 하 고 이식 박동 복 부의 촉진을 통해 측정 하 여 쉽게 평가 될 수 있다. 여기 우리는 쥐에 심장 이식에 관용을 유도 하는 세 가지 프로토콜을 제안 합니다. 이 모델에서 공차는 유도 및/또는 다른 규제 셀에 의해 유지. 첫째, CD40 CD40L 상호작용 CD40Ig 인코딩 하는 아 데 노 바이러스의 차단 CD8의 생성을 유도 하는 (AdCD40Ig)+ Tregs 허용 때 adoptively 유도 전송 보조 이식할된 받는 사람1. 또한, CD8의 고갈+ AdCD40Ig 치료 받는 사람 생성 된 Bregs 및 RegMCs2(와 반대로 CD8α 항 체) 세포. CD8의 깊은 분석+ Tregs 속성 인터 루 킨-34 (IL-34) 및 Fibroleukin-2 (FGL-2)3,,45,6로 정의 하는 여러 immunoregulatory 분자의 중요 한 역할을 강조 . 반면 (AAV 벡터)와 IL-34의 overexpression RegMCs의 세대를 통해 Tregs 유도, FGL-2의 overexpression 유도 Bregs, 규정 하는 세포의 복잡 한 네트워크를 기본.
만성 거부 천천히 개발 하 고 장기는, 때문에 만성 거부 대 공차를 구별 하는 심층 분석 필요 합니다. 이식 세포 침투에 대 한 평가 일반적으로 섬유 증, 혈관 벽 및 보완 C4d 증 착의 immunohistology7에 의해 두껍게. 조직학 방법 동물 희생을 요구 또는 생 검 이식, 여기 우리가 용납된 이식의 다양 한 기능을 평가 하는 간단한 방법 설명: 출현 그리고 규정 하는 세포와 혈액에서 항 기증자 특정 항 체 응답의 기능 cytometry에 의해 샘플 (여기, 우리 형광 활성화 된 세포 (FACS) 정렬 사용).
공차는 이식 치료의 체포 후의 유지 보수 규제 세포8의 유도와 일반적으로 연결 됩니다. 마지막 십 년간에서 연구에 초점을 맞춘 CD4+Tregs 만장일치로 그들 키 마커로 Foxp3+, CD25높은, 그리고 특징 CD127–9,,1011. 마찬가지로, 여러 마커 CD8에 기인 했다+ CD122 같은 Tregs+, CD28–, CD45RC낮은, PD1+, 헬 리오스+ 1,12,,1314 , 15 , 16 , 17. 년, GITR, CTLA4, 및 cytokines의 표현 (IL-10, TGFβ, 일리노이-34, IL-35, FGL-2)는 Treg 프로필3,4,6,13, 또한 연결 했다 18,19,,2021. 그러나, Bregs, RegMCs, 또는 NKTregs, 같은 신흥 규제 세포 인구 관련 특정 마커 부족합니다. 실제로, Bregs는 주로 보고 미 숙 CD24+ 세포, 모호한 CD27 식 및 때때로 IL-10, TGFβ, 또는 granzyme B22,,2324의 생산. 골수성 세포 계보의 복잡성 CD14, CD16, CD80, CD86, CD40, CD209a, 또는 CD16325,26등 규제 또는 proinflammatory 그들의 프로필을 정의 하는 여러 마커의 조합을 요구 한다. 마지막으로, 일부 마커 NKTregs CD11b 등을 식별 하기 위해 보고 된+, CD27+, TGFβ+, 하지만 더 많은 연구 하는 데 필요한 추가 phenotypically 설명27,28,29 ,30,,3132. 따라서, 진압 활동의 증거 추가, 새로운 바이오 마커의 식별 phenotypic 설명 합법화 하는 데 필요한 새로운 immunoregulatory 중재자, 새로운 세포 치료의 범위를 확장 하 고.
셀의 진압 활동을 평가 하는 두 가지 보완 방법 제안 한다. 첫째, 생체 외에서 메서드 표시 효과 기 T 세포 수용자 기증자 항 원 제시 세포 (Apc) 다른 비율 6 일 동안에 의해 자극된 된 진압 세포 배양으로 구성 되 고는 이펙터 분석 T 세포 확산을 기증자 감독 면역 억제를 반영 한다. 세포 치료 쥐에서 직접 셀에 순진한 쥐 및 진압 활동에 대 한 (또는 다른 규제 셀 인구), 치료 비 이식할된 쥐에서 억압: 이펙터 비율의 범위에서 비교할 수 있습니다. 또한,이 방법은 어떤 이식 필요 하지 않습니다 및 결과 6 일 이내에 얻을 수 있습니다. 둘째, vivo에서 메서드는 새로 비친된 이식할된 받는 사람에 게 의도 된 규정 하는 세포 치료 쥐에서 전송 이루어져 있다. B 세포, 골수성 세포 또는 T 세포에서 치료 비 순 쥐가 일반적으로 급성 거부 하 고 입양 전송 시 이식 생존을 머리말을 붙이는 수, 취급 받는 potentiated 진압 활동 세포는 이러한 특성 1,2,3,,433. Lymphopenia 받는 방사선에 의해 유도 된 혈액 항상성 영향을 받지 남아 adoptively 전송된 셀 안티 기증자 면역 응답을 보다 쉽게 습득 하도록 허용 하는 것이 좋습니다. 두 방법, 수용자의 생체 외에서 이용 가능 하 여 타사 Apc 또는 vivo에서 입양 양도 진압에 대 한 받는 사람 제 마음으로 투입으로 셀 안티 기증자 특이성의 분석을 수 있습니다. 하지만 비보에 방법 상당수 셀, 제대로 표현 해야 진압 활동 생체 외에서33셀 부분 모집단을 보다 쉽게 평가 수 있습니다.
체액 응답 또한 관용의 상태 및 기증자 항 원에 대 한 감독된 항 체 응답의 평가를 측정할 수 있습니다. 실제로, 공차 기증자 향해 체액 반응의 부재 하지만 새로운 항 원에 체액 응답을 개발 하는 받는 사람에 대 한 능력의 보존 및 메모리 응답의 보존에 의해 특징 수 있습니다. 첫째, alloantibody 검출의 원리의 기증자 세포 혈 청 부 화 이식할된 받는 사람에서 다음 받는 사람 항 체에 의해 기증자 세포의 인식에 기반. 둘째, 체액 응답 외 인 항 원에 감독의 장기 허용 받는와 열쇠 구멍 삿 Hemocyanin (KLH) 완전 한 Freund의 보조 제와 유화 평가 다음 자극 될 수 있습니다. 특정 항 원에 대하여 IgM와 IgG 항 체의 존재 감지할 수 있습니다 4와 13 일 각각, 면역, 효소 연결 된 ImmunoSorbent 분석 결과 (ELISA)34와 함께 다음. 셋째, 면역 메모리 응답의 보존-7 및 3 일 이식의 Rbc + 8 및 17 다음 이식 받는 사람 혈 청 일에 수집된으로 얼룩 xenogeneic 적혈구 (Rbc)의 주입에 의해 평가 될 수 있다. 이러한 모든 메서드는 특정 보조 항 체와 FACS 얼룩에 의해 미만 1.5 h에 결과의 신속한 취득 또는 ELISA에 의해 몇 시간을 사용 하 여 면역 글로불린의 식별에 대 한 수 있습니다.
마지막으로, 이러한 프로토콜 이식 모델의 특성을 위해 디자인 되 고 어느 정도까지, 자가 면역 질환 모델에 적용 될 수 있습니다. 방법의 원리는 모든 수 종 조 변경 될 수 있습니다.
새로 이식할된 받는 사람으로 총 splenocytes의 입양 전송 규제 세포 유도 또는 치료에 의해 potentiated의 존재를 검색 하는 효율적인 방법입니다. 호스트 방사선-유도 된 과도 lymphopenia 전송 후 세포 생존 및 관용의 설립을 촉진합니다. 또한, 하위 치명적인 방사선 면역 재구성, 전염 성 관용34라는 현상 동안 새로운 규정 하는 세포로 변환 하는 tolerogenic 속성으로 셀에 대 한 시간을 떠?…
The authors have nothing to disclose.
이 작품은 ANR (ANR-11-LABX-0016-01)와 IHU Cesti 프로젝트 또한으로 자금을 관리 하는 “Investissements d’Avenir” 프랑스 정부 프로그램의 일부인 Labex IGO 프로젝트 (n ° ANR-11-LABX-0016-01)의 컨텍스트에서 실현 합니다 ” Investissements d’Avenir”프랑스 정부 프로그램, 여는 프랑스 국가 연구 기관 (ANR) (ANR-10-IBHU-005) 관리. IHU-Cesti 프로젝트도 낭트 메트로 지구의 드 라 루아르에 의해 지원 됩니다.
animals | |||
LEW.1W and LEW.1A rats | Janvier Labs, France | 8 weeks old, | |
BN third party donor rats | Janvier Labs, France | 8 weeks old, | |
İsim | company | catalogue number | comments |
reagents | |||
AdCD40Ig | Viral Vector Core, INSERM UMR 1089, Nantes, France | home made plasmids | |
IL34-AAV | Viral Vector Core, INSERM UMR 1089, Nantes, France | home made plasmids | |
FGL2-AAV | Viral Vector Core, INSERM UMR 1089, Nantes, France | home made plasmids | |
anti-TCR | Hybridoma from European Collection of Cell Culture, Salisbury, U.K | R7/3 clone | Home made culture, purification and fluororophore coupling |
anti-CD25 | Hybridoma from European Collection of Cell Culture, Salisbury, U.K | OX39 clone | Home made culture, purification and fluororophore coupling |
anti-CD8 | Hybridoma from European Collection of Cell Culture, Salisbury, U.K | OX8 clone | Home made culture, purification and fluororophore coupling |
anti-CD45RA | Hybridoma from European Collection of Cell Culture, Salisbury, U.K | OX33 clone | Home made culture, purification and fluororophore coupling |
anti-CD161 | Hybridoma from European Collection of Cell Culture, Salisbury, U.K | 3.2.3 clone | Home made culture, purification and fluororophore coupling |
anti-CD11b/c | Hybridoma from European Collection of Cell Culture, Salisbury, U.K | OX42 clone | Home made culture, purification and fluororophore coupling |
anti-TCRgd | Hybridoma from European Collection of Cell Culture, Salisbury, U.K | V65 clone | Home made culture, purification and fluororophore coupling |
anti-CD45RC | Hybridoma from European Collection of Cell Culture, Salisbury, U.K | OX22 clone | Home made culture, purification and fluororophore coupling |
anti-CD4 | Hybridoma from European Collection of Cell Culture, Salisbury, U.K | OX35 clone | Home made culture, purification and fluororophore coupling |
anti-CD45R | BD Biosciences, Mountain View, CA | #554881, His24 clone | |
anti-rat IgG-FITC | Jackson ImmunoResearch Laboratories, INC, Baltimore, USA | #112-096-071 | |
anti-rat IgG1 | Serotec | #MCA 194 | |
anti-rat IgG2a | Serotec | #MCA 278 | |
anti-rat IgG2b | Serotec | #MCA 195 | |
anti-rat IgM-FITC | Jackson ImmunoResearch Laboratories, INC, Baltimore, USA | #115-095-164 | |
streptavidin HRP | BD Biosciences, Mountain View, CA | #554066 | |
KLH | Sigma Aldrich, St. Louis, USA | #9013-72-3 | |
PBS 1X | Thermo Fisher Scientific Inc, USA | Phosphate Buffer Solution without calcium and magnesium, | |
Tween 20 | Sigma, Saint-Louis, USA | #9005-64-5 | |
TMB substrate reagent kit | BD Biosciences, Mountain View, CA | #555214 | |
CellTraceTM CFSE cell proliferation kit | Thermo Fisher Scientific Inc, USA | #C34554 | |
RPMI 1640 medium 1X | Thermo Fisher Scientific Inc, USA | #31870-025 | |
penicilline streptomycine | Thermo Fisher Scientific Inc, USA | #15140-122 | |
Hepes Buffer | Thermo Fisher Scientific Inc, USA | #15630-056 | |
non essential amino acids | Thermo Fisher Scientific Inc, USA | #11140-035 | |
Sodium pyruvate | Thermo Fisher Scientific Inc, USA | #11360-039 | |
2 beta mercaptoethanol | Sigma, Saint-Louis, USA | #M3148 | |
Cell Proliferation Dye eFluor® 450 Cell | Thermo Fisher Scientific Inc, USA | #65-0842-85 | |
Glutamine | Sigma, Saint-Louis, USA | #G3126 | |
DAPI | Thermo Fisher Scientific Inc, USA | #D1306 | |
Collagenase D | Roche Diagnostics, Germany | #11088882001 | |
EDTA | Sigma, Saint-Louis, USA | #E5134 | |
NaCl 0.9% | Fresenius Kabi | #B230561 | |
Magnetic dynabeads | Dynal, Invitrogen | #11033 | Goat anti-mouse IgG |
One Comp eBeads | Ebiosciences, San Diego, USA | #01-1111-42 | |
Betadine | Refer to the institutional guidelines | ||
Isoflurane | Refer to the institutional guidelines | ||
Naplbuphine | Refer to the institutional guidelines | ||
Terramycine | Refer to the institutional guidelines | ||
Buprenorphine | Refer to the institutional guidelines | ||
Meloxicam | Refer to the institutional guidelines | ||
Complete Freund's adjuvant | |||
Rompun | Refer to the institutional guidelines | ||
Ringer lactate | Refer to the institutional guidelines | ||
Ketamine | Refer to the institutional guidelines | ||
Red blood cell lysis solution | Dilute 8,29g NH4Cl (Sigma, Saint-Louis, USA A-9434), 1g KHCO3 (Prolabo 26 733.292) and 37.2mg EDTA (Sigma, Saint-Louis, USA E5134) in 800ml H2O. Adjust pH to 7.2-7.4 and complete to 1L with H2O. | ||
Collagenase D | Dilute 1g collagenase in 500 ml RPMI-1640 + 5 ml Hepes + 2% FCS | ||
PBS-FCS (2%)-EDTA (0.5%) | Add 5 mL EDTA 0,1M (Sigma, Saint-Louis, USA E5134) and 20ml FCS to 1ml PBS 1X | ||
CFSE (Vybrant CFDA SE Cell Tracer Kit Invitrogen) | Dilute 50µg (=1 vial) of CFDA SE (component A) in 90μl DMSO (component B) solution to obtain a 10mM stock solution. Then, dilute stock solution at 1/20 000 in PBS 1X to obtain a 0.5μM solution | ||
complete medium for coculture | 500ml complete RPMI-1640 medium with 5 ml Penicillin (80 unit/ml)-Steptomycin (80 mg/ml), 5 ml L-Glutamine, 5 ml Non Essential Amino Acids (100X), 5ml Pyruvate Sodium (100mM), 5 ml HEPES buffer (1M), 2.5 ml b mercaptomethanol (7 ml of 2-bmercaptoethanol stock diluted in 10 ml RPMI), 10% FCS | ||
İsim | company | catalog number | comments |
equipments | |||
falcon 50ml | BD Biosciences, Mountain View, CA | #227261 | |
falcon 15ml | BD Biosciences, Mountain View, CA | #188271 | |
sieve | |||
Corning plastic culture dishes | VWR, Pessac | #391-0439 | |
100µm and 60µm tissue filters | Sefar NITEX, Heiden, Switzerland | #03-100/44 and #03-60/35 | |
96 wells U bottom plates for coculture | Falcon U-bottom Tissue Culture plate, sterile, Corning | #353077 | |
96 wells V bottom plates for FACS staining | ThermoScientifique, Danemark | #249570 | |
96 wells flat bottom ELISA plates | Nunc Maxisorb | ||
seringue for spleen crush | BD Biosciences, Mountain View, CA | #309649 | |
ELISA reader | SPARK 10M, Tecan, Switzerland | SPARK 10M, Tecan, Switzerland | |
centrifuge | |||
bain marie | |||
X rays irradiator | Lincolshire, England | Faxitron CP160 | |
solar agitator | |||
FACS Canto II | BD Biosciences, Mountain View, CA | ||
FACS Aria II | BD Biosciences, Mountain View, CA | ||
magnet | Thermo Fisher Scientific Inc, USA | 12302D |